【摘要】： 第一部分Notch信號系統(tǒng)對骨骺干細胞生長的調(diào)控作用 實驗1骨骺干細胞的體外培養(yǎng)及生長特性觀察 目的:探討體外培養(yǎng)鼠骨骺干細胞及其生長特性觀察,為其應用奠定基礎。 方法:采用顯微取材后酶消化獲取骨骺干細胞,用Percoll密度梯度離心法純化,并測定其細胞生長曲線、細胞分裂指數(shù)、堿性磷酸酶活性,用免疫組化及免疫熒光染色的方法檢測Ⅱ、Ⅹ型膠原的合成情況和透射電鏡觀察粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的豐富程度。 結(jié)果:鼠骨骺干細胞形狀類似成纖維細胞,呈梭型,堿性磷酸酶活性低,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)少,Ⅱ型膠原合成量較多。 結(jié)論:體外培養(yǎng)的骨骺干細胞能向成熟階段分化,可為軟骨或骨組織工程提供理想的種子細胞。 實驗2 Notch1信號系統(tǒng)對骨骺干細胞增殖與分化調(diào)控作用的初步觀察 目的:研究激活的Notch1信號系統(tǒng)對體外培養(yǎng)的骨骺干細胞增殖與分化的調(diào)控作用。 方法:向體外培養(yǎng)的骨骺干細胞中分別加入Notch1激活劑rhNF-κB和抑制劑γ-secretase inhibitorⅡ(MW167),空白對照加PBS緩沖液。用RT-PCR、免疫組化、MTT、流式細胞儀、堿性磷酸酶染色和Western Blot方法檢測。 結(jié)果:骨骺干細胞中有Notch1和Jagged1表達;與對照組相比,rhNF-κB誘導組表達PCNA、CollagenⅡ蛋白明顯增多,促細胞增殖作用明顯(p=0.027),并且進入分裂期(S期)細胞增多(26.54%),而MW167誘導組堿性磷酸酶、CollagenⅩ蛋白表達明顯增多,CollagenⅡ蛋白及分化標志蛋白stathmin表達明顯減少。 結(jié)論:當Notch信號系統(tǒng)被激活時,骨骺干細胞進行增殖;當Notch信號系統(tǒng)被抑制時,骨骺干細胞進行分化。 實驗3激活的Notch1信號系統(tǒng)抑制骨骺干細胞凋亡及其機制研究 目的:研究激活的Notch1信號系統(tǒng)抑制體外培養(yǎng)的骨骺干細胞凋亡及其機制。 方法:用RT-PCR檢測骨骺干細胞中Notch信號系統(tǒng)的表達,并分別向培養(yǎng)細胞中加入Notch1激活劑rhNF-κB、抑制劑γ-secretase inhibitorII(MW167)和Bcl-2抑制劑HA 14-1,空白對照加PBS緩沖液,在凋亡誘導劑Celecoxib誘導后,用MTT檢測細胞活力、流式細胞術檢測細胞凋亡和Western Blot檢測Hes-1及Bcl-2蛋白的表達。 結(jié)果:骨骺干細胞中存在Notch1/Jagged1信號通路,rhNF-κB組細胞活力增加,凋亡較少,Hes-1蛋白和Bcl-2蛋白表達明顯增加,而MW167組、HA 14-1組和對照組細胞凋亡明顯,差異有顯著意義(p0.05),且HA 14-1組和HA 14-1協(xié)同rhNF-κB組無Bcl-2表達。 結(jié)論:激活的Notch1信號系統(tǒng)通過促進靶基因Hes-1和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達來抑制骨骺干細胞凋亡。 實驗4 Notch信號系統(tǒng)對體外培養(yǎng)的鼠肢芽生長的調(diào)節(jié)作用 目的:研究Notch信號系統(tǒng)對體外培養(yǎng)器官生長的調(diào)節(jié)作用。 方法:體外培養(yǎng)孕16天鼠肢芽,通過測量其縱向生長長度、HE染色和甲苯胺藍染色觀察骨骺干細胞增殖與分化。 結(jié)果:與對照組相比,rhNF-κB實驗組鼠肢芽縱向生長遲緩,MW167實驗組縱向生長速度較快,差異有顯著意義(p0.05)。rhNF-κB實驗組表現(xiàn)出靜止區(qū)骨骺干細胞明顯增多,增殖區(qū)和肥大區(qū)成熟細胞所占比例較少;MW167實驗組表現(xiàn)出骨骺干細胞明顯處于分化狀態(tài),靜止區(qū)骨骺干細胞非常少,增殖區(qū)和肥大區(qū)成熟軟骨細胞所占比例明顯增多。 結(jié)論:激活的Notch信號系統(tǒng)不僅對體外培養(yǎng)的骨骺干細胞增殖、分化有調(diào)節(jié)作用,而且對肢體內(nèi)骨骺干細胞的增殖與分化也有調(diào)節(jié)作用。 第二部分Notch和PTHrP雙信號系統(tǒng)的調(diào)控作用 實驗5 Notch和PTHrP雙信號系統(tǒng)調(diào)節(jié)鼠骨骺干細胞增殖與分化及其機制研究 目的:研究Notch和PTHrP雙信號系統(tǒng)對骨骺干細胞生長的立體調(diào)節(jié)及其機制。 方法:通過免疫組化的方法檢測Notch、PTHrP和AP-1共表達;轉(zhuǎn)染PTHrP后MTT檢測PTHrP協(xié)同Notch促進骨骺干細胞增殖,Western blot方法檢測PTHrP協(xié)同Notch抑制其分化及PTHrP和AP-1的表達。 結(jié)果:當Notch信號系統(tǒng)被激活時,明顯促進PTHrP和AP-1蛋白的表達;轉(zhuǎn)染PTHrP基因后,促進骨骺干細胞增殖作用明顯加強(p0.05),collagenX表達也明顯減少,明顯抑制骨骺干細胞分化;Notch被激活時,明顯促進AP-1和PTHrP表達,Notch被抑制時,無AP-1和PTHrP表達。 結(jié)論:Notch通過介導AP-1來促進PTHrP的表達,Notch起橫向調(diào)節(jié)作用,PTHrP起縱向調(diào)節(jié)作用,在骨骺干細胞生長分化過程中成立體調(diào)節(jié)。
[Abstract]:Regulation of the first part of Notch signaling system on the growth of bone-derived stem cells Experiment 1. body of bone-derived stem cells Objective of the observation of external culture and growth characteristics: to study the culture of rat bone in vitro The cell and its growth characteristics were observed and the basis was laid for its application. Methods: The bone-derived stem cells were obtained by microextraction, and purified by Percoll density gradient centrifugation, and the cell growth curve and cell division were determined. index, alkaline phosphatase activity, immunohistochemistry and immunofluorescent staining The synthesis of type 鈪，

本文編號：2491885