【摘要】： 人類白細(xì)胞抗原-G(humanleukocyteantigen-G,HLA-G)是位于人第六號染色體短臂上的一群緊密連鎖基因群,HLA-G屬于非經(jīng)典HLA-I類分子,是表達(dá)于母胎界面滋養(yǎng)層的HLA-I類基因,是重要的免疫耐受分子。主要有3個(gè)特點(diǎn):選擇性組織分布;有限的分子多態(tài)性;mRNA選擇性剪接形成不同的異構(gòu)體分子,分別編碼不同的蛋白質(zhì)分子亞型。HLA-G編碼基因及分子結(jié)構(gòu)與經(jīng)典HLA-I類分子相似。早期認(rèn)為HLA-G限制性表達(dá)于正常妊娠時(shí)母胎界面的絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)HLA-G蛋白還表達(dá)于胎兒絨毛膜絨毛的血管內(nèi)皮細(xì)胞、羊水、絨毛基底層的增殖性細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞及胸腺上皮組織等部位。HLA-G這種獨(dú)特的表達(dá)方式對于維持正常妊娠有著重要的作用,育齡婦女HLA-G基因表達(dá)異常會引起不孕、習(xí)慣性流產(chǎn)、妊娠高血壓疾病等病理性妊娠。近來發(fā)現(xiàn),HLA-G分子還能抑制NK細(xì)胞、T細(xì)胞的細(xì)胞溶解作用、誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞凋亡,以及調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的釋放,進(jìn)而影響機(jī)體免疫反應(yīng)。因此,HLA-G是人類生殖中的重要調(diào)控蛋白,研究HLA-G基因在妊娠中的功能在人類生殖學(xué)和免疫學(xué)具有重要的理論意義,有望成為人類輔助生殖中評價(jià)胚胎潛能的重要生化指標(biāo)。 外源和內(nèi)源性雙鏈RNA(double-strandedRNA.dsRNA)在細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)同源序列基因表達(dá)受抑制的現(xiàn)象稱為RNA干擾(RNAinterfering.RNAi)。RNAi現(xiàn)象在一系列的生物中存在,包括植物、真菌、錐蟲、囊蟲、果蠅和線蟲。在培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中也觀察到這一現(xiàn)象。越來越多的研究人員開始采用小分子干擾RNA(smallinterferingRNA,siRNA)來抑制特定的哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因的表達(dá)。RNAi技術(shù)研究結(jié)果表明構(gòu)建的載體有效表達(dá)了siRNA,這些載體術(shù)不僅能提供一種經(jīng)濟(jì)、快捷、高效的抑制基因表達(dá)的技術(shù)手段,而且在基因功能測定,基因治療等方面開辟一條新思路。 目的:1.構(gòu)建針對HLA-G基因的siRNA真核表達(dá)質(zhì)粒載體,將其轉(zhuǎn)染人絨癌JEG-3細(xì)胞株,觀察其對人絨癌細(xì)胞JEG-3中HLA-G蛋白表達(dá)的沉默效應(yīng);2.建立HLA-G穩(wěn)定降調(diào)節(jié)的JEG-3細(xì)胞株;3.針對HLA-G蛋白的降表達(dá)對NK-92MI細(xì)胞殺傷效應(yīng)的檢測。 方法:①依據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則,結(jié)合HLA-G基因的序列特征,借助生物信息學(xué)軟件在線設(shè)計(jì)了兩對靶向HLA-G基因的siRNA,并經(jīng)本室檢測有明顯抑制效應(yīng)。應(yīng)用基因重組技術(shù),構(gòu)建HLA-G基因的siRNA真核表達(dá)質(zhì)粒載體p S u p p r e s s o r - U 6 - n e o - H L A - G (簡稱p S u p - H L A - G )及陰性對照pSuppressor-U6-neo-ns(簡稱pSup-ns),并對其進(jìn)行鑒定。應(yīng)用脂質(zhì)體分別將質(zhì)粒pSup-HLA-G,pSuppressor-U6-neo空載體、pSuppressor-U6-neo-ns瞬時(shí)轉(zhuǎn)染JEG-3細(xì)胞,應(yīng)用RT-PCR、Western-blot等方法鑒定瞬時(shí)轉(zhuǎn)染前后各組JEG-3細(xì)胞中HLA-G基因mRNA及蛋白表達(dá)水平有無變化;②經(jīng)過G418抗性篩選,獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系,應(yīng)用RT-PCR、Western-blot等方法檢測、比對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染siRNA真核表達(dá)載體前后JEG-3細(xì)胞中HLA-G基因mRNA及蛋白表達(dá)水平的變化情況;③將NK-92MI細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞)與JEG-3細(xì)胞及降調(diào)節(jié)HLA-G的JEG-3細(xì)胞(靶細(xì)胞)共同培養(yǎng),以LDH釋放法觀察不同效靶比例時(shí)NK-92MI細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。 結(jié)果:①成功地構(gòu)建了HLA-G基因siRNA真核表達(dá)質(zhì)粒載體pSup-HLA-G,RT-PCR及Western-blot等方法檢測表明瞬時(shí)轉(zhuǎn)染siRNA及pSup-HLA-G的JEG-3細(xì)胞中HLA-G基因mRNA及蛋白表達(dá)均受到明顯抑制;②建立了穩(wěn)定降調(diào)節(jié)HLA-G基因表達(dá)的JEG-3細(xì)胞株;③NK-92MI細(xì)胞針對轉(zhuǎn)染HLA-G的siRNA的滋養(yǎng)細(xì)胞的殺傷力增強(qiáng)了,說明HLA-G具有保護(hù)滋養(yǎng)細(xì)胞免受NK細(xì)胞殺傷的作用。 結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)利用RNAi技術(shù)及基因重組技術(shù),成功構(gòu)建了pSup-HLA-G重組質(zhì)粒;建立了穩(wěn)定的HLA-G蛋白降表達(dá)的JEG-3細(xì)胞株,并證明了HLA-G具有保護(hù)滋養(yǎng)細(xì)胞免受NK細(xì)胞殺傷的作用。我們的研究為進(jìn)一步研究HLA-G的生物學(xué)功能提供了平臺,同時(shí)為進(jìn)一步研究HLA-G的免疫學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R714;R392

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本文編號：2489505