【摘要】： 研究目的:為建立檢測(cè)血清中晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)濃度的微量測(cè)定技術(shù),為糖尿病慢性并發(fā)癥的診斷、治療及預(yù)后評(píng)估提供依據(jù),本研究試圖制備抗人AGEs單克隆抗體。 研究方法:D-葡萄糖和人血清白蛋白(HSA)溶解于磷酸鹽緩沖液(PBS)中,37℃恒溫孵育12周,同時(shí)以不含D-葡萄糖的HSA為對(duì)照。12周后透析凝膠過濾純化,熒光測(cè)定、蛋白定量及聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳鑒定。取100μg純化后的第一峰AGE-HSA加等體積福氏佐劑免疫Babl/c小鼠,共3次,用聚乙二醇(PEG)行細(xì)胞融合,用雜交瘤細(xì)胞選擇性培養(yǎng)基次黃嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷(HAT)及次黃嘌呤、胸腺嘧啶核苷(HT)選擇性培養(yǎng),間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)篩選培養(yǎng)上清,包被的抗原為純化后的第一峰AGE-HSA,選擇對(duì)AGEs陽(yáng)性,對(duì)HSA陰性的多克隆孔進(jìn)行亞克隆,間接ELISA篩選亞克隆板孔的細(xì)胞培養(yǎng)上清。收集陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株,注射Babl/c小鼠制備腹水,經(jīng)固相化甘露聚糖結(jié)合蛋白(MBP)柱純化腹水。行亞型鑒定,并通過間接ELISA、western blot對(duì)抗體行特異性鑒定,并進(jìn)行染色體鑒定。 結(jié)果:D-葡萄糖和HSA孵育12周后,反應(yīng)液呈棕色,SDS-PAGE示分子量大于HSA的葡萄糖-HSA偶聯(lián)產(chǎn)物,熒光測(cè)定表明產(chǎn)物系A(chǔ)GEs。經(jīng)Sephadex G-200純化后,得到高分子量和低分子量的兩個(gè)蛋白峰,分別稱為第一峰和第二峰。第一峰作為免疫原,免疫Babl/c小鼠后血清滴度大于1:106,細(xì)胞融合后篩選,獲得陽(yáng)性多克隆,經(jīng)亞克隆,得到5株陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株。染色體鑒定示其染色體為106條。擴(kuò)增5株細(xì)胞株,注射小鼠腹腔產(chǎn)生腹水,亞型鑒定為IgM型,抗體特異性鑒定示對(duì)AGE-HSA有特異性。 結(jié)論:獲得抗人AGE-HSA單克隆抗體細(xì)胞株5株,抗體亞型為IgM型。
[Abstract]:Objective: To establish a micro-assay for detecting the concentration of advanced glycation terminal product (AGEs) in serum, and to provide the basis for the diagnosis, treatment and prognosis evaluation of the chronic complications of diabetes. Methods: D-glucose and human serum albumin (HSA) were dissolved in phosphate buffer (PBS), incubated at 37 鈩，

本文編號(hào)：2482056