【摘要】： PTEN是近年來新確定的唯一具有雙重磷酸酶活性的腫瘤抑制基因,是p53后時代最重要的抑癌基因。PTEN定位于常染色體10q23.3,具有脂質(zhì)磷酸酶和蛋白磷酸酶活性�，F(xiàn)已證實,在多種人類的惡性腫瘤,包括腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、黑素瘤、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌等都存在著PTEN基因的突變或缺失。PTEN主要通過PI3K/Akt、FAK、MAPK三條信號通路發(fā)揮作用,調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、凋亡、遷移和轉(zhuǎn)化。研究發(fā)現(xiàn), PTEN在負(fù)性調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cells, NSCs)的增殖、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的分化以及突觸的正確建立、協(xié)調(diào)室管膜下區(qū)(Subventricular zone ,SVZ)前體細(xì)胞增殖、凋亡和遷移之間的平衡中具有重要作用,其缺失易導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)育障礙。對腦PTEN的首次報道是來自于人活體組織檢測,檢測發(fā)現(xiàn)PTEN在神經(jīng)元胞體,尤其是胞核有強(qiáng)免疫染色。此外在大鼠脊髓、體外培養(yǎng)的小腦顆粒細(xì)胞,以及成年小鼠嗅球、大腦皮層、基底前腦、海馬、杏仁體、小腦都可以觀察到PTEN的表達(dá),提示PTEN在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system, CNS)中具有重要作用。但目前對于PTEN在正常成年CNS的表達(dá)和功能并未見比較系統(tǒng)的報道。 Akt,又稱蛋白激酶B (protein kinase B, PKB),是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶,廣泛表達(dá)于體內(nèi)各組織。研究表明,Akt能在生長因子,如胰島素樣生長因子-1(Insulin-like growth factor-1, IGF-1)和神經(jīng)營養(yǎng)因子的刺激下經(jīng)過磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase, PI3K)依賴的磷酸化而被激活,其功能涉及細(xì)胞營養(yǎng)代謝、細(xì)胞存活與生長、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控、血管形成等諸多方面。在細(xì)胞存活信號通路中磷酸化Akt(p-Akt)通過作用于BAD、Caspase-9、GSK-3、CREB、Forkhead轉(zhuǎn)錄因子、NF-κB等下游靶分子,從多途徑發(fā)揮其生物學(xué)作用。 腦缺血損傷是神經(jīng)系統(tǒng)的多發(fā)病之一,常導(dǎo)致遲發(fā)性神經(jīng)元死亡(Delayed neuronal death, DND),而DND又與細(xì)胞凋亡密切相關(guān),其涉及機(jī)制較為復(fù)雜,發(fā)生的病理生理過程主要包括能量代謝紊亂、氧自由基產(chǎn)生、Ca2+超載、啟動凋亡與壞死、激活抗損傷因素等。研究顯示,p-Akt在腦缺血損傷中具有重要的神經(jīng)保護(hù)作用,它能通過PI3K/Akt信號通路抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞存活。研究報道,p-Akt的表達(dá)在某些腦缺血模型的神經(jīng)元中呈雙向變化,在另一些模型的星形膠質(zhì)細(xì)胞中則持續(xù)上調(diào)。PTEN與PI3K作用相反,能降低PIP3的水平,從而降低Akt活性,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在不同的腦缺血模型中其表達(dá)變化規(guī)律和發(fā)揮作用的細(xì)胞類型也具有差異性。那么兩者在急性不完全性全腦缺血模型中的表達(dá)如何?作用的細(xì)胞類型?PTEN/Akt信號通路在其中是否發(fā)揮了重要作用?目前未見相關(guān)研究報道。 因此,本研究首先以正常成年大鼠為研究對象,采用免疫組織化學(xué)方法觀察PTEN在正常成年大鼠CNS中的表達(dá)模式,然后在此基礎(chǔ)上建立大鼠急性不完全性全腦缺血模型,應(yīng)用western blot和免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察PTEN和p-Akt在腦缺血再灌注不同時間點在大腦的表達(dá)情況,期望為進(jìn)一步闡明PTEN和p-Akt在腦缺血損傷中的調(diào)控機(jī)制積累更豐富的資料。所得主要結(jié)果如下: 1. PTEN陽性反應(yīng)產(chǎn)物廣泛分布于大鼠的CNS內(nèi),包括端腦、大腦、間腦、腦干、小腦和脊髓。(1)在不同核團(tuán)PTEN陽性細(xì)胞的分布是不均勻的,主要出現(xiàn)較多、中等量和少量三種情況。(2)多數(shù)陽性細(xì)胞胞體較大,呈錐形、梭形或橢圓形,染色較深。(3)在細(xì)胞內(nèi)的分布包括胞體、胞核和胞體突起;胞體和胞核;胞體和胞體突起。(4)PTEN與GFAP、APC的共表達(dá)情況:大部分PTEN陽性細(xì)胞與GFAP陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞及APC陽性的少突膠質(zhì)細(xì)胞沒有共表達(dá)。結(jié)果提示:(1)PTEN可能參與了CNS的多種功能,對維持CNS的正�；顒泳哂兄匾饔�。(2)PTEN在不同核團(tuán)的不均勻分布可能與核團(tuán)本身的相對細(xì)胞數(shù)量以及腦區(qū)的功能有關(guān)。(3)PTEN在細(xì)胞內(nèi)的分布不同一方面可能是由于細(xì)胞類型的不同,一方面可能是由于不同定位涉及的信號通路不同,除了PI3K/Akt信號通路外,PTEN還可能通過FAK、MAPK等不同的信號通路發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用。(4) PTEN可能主要在神經(jīng)元中表達(dá),其在膠質(zhì)細(xì)胞的缺失可能和神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。 2.PTEN、p-Akt在不完全性全腦缺血再灌注模型的表達(dá)特點如下:(1)PTEN在各時間點的表達(dá)都較強(qiáng),且隨再灌注時間持續(xù)緩慢上調(diào)。(2)p-Akt在假手術(shù)對照組的表達(dá)很弱,在再灌注后表達(dá)逐漸增強(qiáng),3d達(dá)頂峰,之后逐漸下降。(3)p-Akt在細(xì)胞內(nèi)分布的改變:在對照組,主要在胞體、突起中表達(dá),缺血后除在胞體、突起中表達(dá)外,在胞核中的表達(dá)增強(qiáng)。(4)PTEN在大腦皮質(zhì)、尾殼核和丘腦以及p-Akt在大腦皮質(zhì)、隔核和嗅結(jié)節(jié)的表達(dá)變化程度是不一致的。(5)熒光雙標(biāo)結(jié)果:PTEN、p-Akt陽性細(xì)胞和GFAP、APC陽性細(xì)胞幾乎沒有共表達(dá),說明兩者在該模型中可能主要在神經(jīng)元中表達(dá)。結(jié)果提示:(1)PTEN/Akt信號通路在該腦缺血模型中可能具有促進(jìn)細(xì)胞存活、抑制凋亡的神經(jīng)保護(hù)作用。除了PI3K/Akt信號通路,PTEN還可能通過其他途徑發(fā)揮調(diào)控作用。(2)p-Akt活性的雙向變化可能與機(jī)體和細(xì)胞內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)反應(yīng)以及細(xì)胞損傷有關(guān)。(3)p-Akt在細(xì)胞內(nèi)分布的改變可能是由于其作用的底物定位于胞核內(nèi)。(4)PTEN和p-Akt在腦區(qū)不同部位的表達(dá)變化程度不一致可能是由于不同部位對缺血的敏感度不同。(5)PTEN、p-Akt在不同模型中作用細(xì)胞類型的差異性可能是由于采用的動物模型以及觀察的部位不同所致。 總之,本實驗從蛋白水平觀察了PTEN在正常成年大鼠CNS的表達(dá)模式以及腦缺血損傷對PTEN、p-Akt表達(dá)的影響,結(jié)果提示PTEN/p-Akt信號通路在該腦缺血模型中可能發(fā)揮了作用,為進(jìn)一步研究PTEN和p-Akt在腦缺血損傷中的調(diào)控機(jī)制以及尋找新的治療途徑提供基礎(chǔ)實驗資料。
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【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R346

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2476870