【摘要】：目的:草酸(Oxalic Acid, Oxalate)是機(jī)體不能進(jìn)一步分解代謝的終產(chǎn)物,對(duì)組織細(xì)胞具有一定的毒性。一般情況下,來(lái)自于機(jī)體代謝的內(nèi)源性草酸(主要在肝臟內(nèi)合成)和腸道從食物中吸收的外源性草酸(包括草酸前體物質(zhì))均以草酸原形形式從尿中排泄。肝臟合成的異常增加和腸道的高吸收是高草酸尿的發(fā)病基礎(chǔ)。產(chǎn)甲酸草酸桿菌(Oxalobacter formigenes, Ox.F)是一種定居于脊柱動(dòng)物腸道,與宿主形成共生關(guān)系的正常菌群(flora),具有分解草酸、調(diào)節(jié)外源性草酸吸收的功能。甲酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因(frc)是Ox.F分解草酸的關(guān)鍵酶基因之一。本研究通過(guò)真核表達(dá)載體克隆產(chǎn)甲酸草酸桿菌frc基因,以探討重組frc基因能否在在真核細(xì)胞中表達(dá),為高草酸尿的基因治療奠定基礎(chǔ)。 方法:提取中國(guó)人腸道產(chǎn)甲酸草酸桿菌的基因組DNA,用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)技術(shù)從產(chǎn)甲酸草酸桿菌基因組DNA中擴(kuò)增frc基因片段并插入真核表達(dá)載體pEGFP-C1,獲取重組質(zhì)粒pEGFP-frc,通過(guò)限制性內(nèi)切酶酶切電泳和測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胚腎293細(xì)胞,通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse Transcription PCR,RT-PCR)和蛋白印跡(Western blot)分別從mRNA和蛋白水平檢測(cè)frc基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)。被轉(zhuǎn)染細(xì)胞在含草酸培養(yǎng)液中培養(yǎng),檢測(cè)0~72h培養(yǎng)液中草酸濃度的變化。 結(jié)果:中國(guó)人腸道產(chǎn)甲酸草酸桿菌frc基因全長(zhǎng)1287bp,存在53個(gè)堿基和4個(gè)氨基酸殘基的變異,與GenBank中的frc基因的堿基序列的同源性為95.88%,氨基酸殘基序列的同源性為99.07%。轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后24~72小時(shí),可觀察到明亮的綠色熒光,RT-PCR和Western blot分別從mRNA和蛋白水平上檢測(cè)到frc基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)。轉(zhuǎn)染pEGFP-frc細(xì)胞12~72h培養(yǎng)液中草酸濃度明顯低于轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞(P0.05)。 結(jié)論:中國(guó)人腸道產(chǎn)甲酸草酸桿菌中可分離出frc基因;中國(guó)人腸道產(chǎn)甲酸草酸桿菌frc基因存在一定的變異;frc基因可在真核細(xì)胞HEK293細(xì)胞中表達(dá)并使HEK293細(xì)胞獲得代謝草酸的能力。 目的:草酸(Oxalic Acid, Oxalate)是機(jī)體不能進(jìn)一步分解代謝的終產(chǎn)物,對(duì)組織細(xì)胞具有一定的毒性。一般情況下,來(lái)自于機(jī)體代謝的內(nèi)源性草酸(主要在肝臟內(nèi)合成)和腸道從食物中吸收的外源性草酸(包括草酸前體物質(zhì))均以草酸原形形式從尿中排泄。肝臟合成的異常增加和腸道的高吸收是高草酸尿的發(fā)病基礎(chǔ)。產(chǎn)甲酸草酸桿菌(Oxalobacter formigenes, Ox.F)是一種定居于脊柱動(dòng)物腸道,與宿主形成共生關(guān)系的正常菌群(flora),具有分解草酸、調(diào)節(jié)外源性草酸吸收的功能。草酰輔酶A脫羧酶基因(oxc)是Ox.F分解草酸的關(guān)鍵酶基因之一。本研究通過(guò)真核表達(dá)載體克隆產(chǎn)甲酸草酸桿菌oxc基因,以探討中國(guó)人腸道產(chǎn)甲酸草酸桿菌(Ox.F)草酰輔酶A脫羧酶基因(oxc)的分離、克隆及其在293細(xì)胞中的表達(dá),為高草酸尿的基因治療奠定基礎(chǔ)。 方法:提取中國(guó)人腸道Ox.F的基因組DNA,PCR擴(kuò)增oxc基因片段并克隆入真核表達(dá)載體pEGFP-C1,通過(guò)限制性內(nèi)切酶酶切電泳和測(cè)序鑒定基因片段。將重組質(zhì)粒脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至人胚腎293細(xì)胞,通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse Transcription PCR,RT-PCR)和蛋白印跡(Western blot)分別從mRNA和蛋白水平檢測(cè)oxc基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)。 結(jié)果:中國(guó)人腸道產(chǎn)甲酸草酸桿菌oxc基因全長(zhǎng)1707bp。與GenBank中的序列比較,存在109個(gè)堿基的變異,同源性為93.61%,由于密碼子的簡(jiǎn)并性,表達(dá)產(chǎn)物將出現(xiàn)16個(gè)氨基酸殘基的變異,同源性為97.18%。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后24~48h,可觀察到明亮的綠色熒光,從mRNA和蛋白水平上可以檢測(cè)到oxc基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)。 結(jié)論:中國(guó)人腸道產(chǎn)甲酸草酸桿菌中可以分離出oxc基因;中國(guó)人腸道產(chǎn)甲酸草酸桿菌oxc基因存在一定的變異;oxc基因可在真核細(xì)胞293細(xì)胞中表達(dá)。
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【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R346;R696
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本文編號(hào)：2456515