【摘要】： 抗體技術(shù)經(jīng)歷了多克隆抗血清,單克隆抗體,發(fā)展到基因工程抗體階段,其最突出的發(fā)展是噬菌體抗體庫技術(shù)的建立。傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體費(fèi)時(shí)費(fèi)力,噬菌體抗體庫技術(shù)的出現(xiàn)使抗體的制備產(chǎn)生了突破性的進(jìn)展。噬菌體抗體庫是以絲狀噬菌體為載體,用分子克隆的方法將外源性基因插入噬菌體衣殼蛋白(pⅢ,pⅧ等)基因中,制備有擴(kuò)增能力且能在表面表達(dá)某一種抗體的融合噬菌體(fusion phage),進(jìn)而經(jīng)過幾輪吸附—洗脫—富集后,可獲得大量目的噬菌體,最終獲得具有特異結(jié)合性質(zhì)的抗體,并實(shí)現(xiàn)基因克隆化的一種重要的分子生物學(xué)技術(shù)。由于噬菌體抗體庫技術(shù)繞過細(xì)胞雜交這一步,避免了雜交瘤細(xì)胞系不穩(wěn)定的缺點(diǎn),較好地解決了人體雜交瘤系統(tǒng)低效的難題,為人類單克隆抗體的制備開辟了廣闊的前景,故被認(rèn)為是繼雜交瘤抗體之后的第三代抗體。雖然噬菌體抗體庫技術(shù)應(yīng)用時(shí)間較短,但在腫瘤的診斷和治療、抗原表位分析、藥物設(shè)計(jì)等多個(gè)領(lǐng)域顯示出了巨大的發(fā)展?jié)撃芎蛷V闊的應(yīng)用前景。 本研究旨在利用噬菌體抗體展示技術(shù)構(gòu)建人源性抗日本血吸蟲Fab段噬菌體抗體庫,以期獲得抗日本血吸蟲的人源化的抗體。首先,我們用對血吸蟲感染具有一定抗性成年人的血清免疫學(xué)方法篩選日本血吸蟲童蟲cDNA文庫,獲得陽性克隆的核苷酸進(jìn)行序列測定,并根據(jù)序列測定結(jié)果,選取其中一個(gè)具有完整開放閱讀框架的SPI(絲氨酸蛋白酶抑制劑),設(shè)計(jì)引物,PCR體外擴(kuò)增,并將其克隆,表達(dá),純化,用于噬菌體抗體庫的篩選。其次,利用RT-PCR方法從上述成年人的外周血淋巴細(xì)胞提取總RNA、分別擴(kuò)增出人IgG輕鏈和重鏈Fd段基因片段,將其克隆入PComb3中,轉(zhuǎn)化入XLI-Blue,經(jīng)輔助噬菌體M13K07超感染,構(gòu)建滴度為6.2×1011/L,庫容量為1.2×107的人源性Fab段噬菌體抗體庫,并用限制性內(nèi)切酶酶切、序列分析、DOT-ELISA以及SDS-PAGE等方法對噬菌體抗體庫進(jìn)行鑒定,結(jié)果顯示成功地構(gòu)建了人源性抗日本血吸蟲Fab噬菌體抗體庫。然后我們再用純化的基因重組日本血吸蟲SPI蛋白,對噬菌體抗體庫進(jìn)行5輪的富集篩選,經(jīng)ELISA實(shí)驗(yàn)鑒定,結(jié)果表明篩選得到人源化特異性抗日本血吸蟲SPI抗體。 本實(shí)驗(yàn)取得的結(jié)果顯示以人的外周血淋巴細(xì)胞成功構(gòu)建了人源性抗日本血吸蟲噬菌體抗體庫并獲得了人源性抗日本血吸蟲SPI抗體,為進(jìn)一步研究這些抗體的免疫學(xué)特性、生物學(xué)活性和功能奠定了基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2442744