【摘要】： 目的： 用免疫動物方法制備FXⅢA亞單位多克隆抗體，并對其進(jìn)行鑒定，檢測其特異性及活性，并將多克隆抗體應(yīng)用于FXⅢ缺乏的檢測和FXⅢ抗原表位分析，為進(jìn)一步研究FXⅢ抑制物作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 方法： 1．免疫動物法制備多克隆抗體 2．Dot blot鑒定抗體，抗體中和／尿素溶解實(shí)驗(yàn)檢測多克隆抗體活性 3．Western blot檢測FXⅢ缺乏及dot blot分析抗原表位 結(jié)果： 1．(1)以兔抗人FXⅢ抗血清孵育過夜的PVDF膜在純化的人FXⅢ、含轉(zhuǎn)氨酶活性位點(diǎn)多肽Ⅱ點(diǎn)樣處均出現(xiàn)陽性信號，，而在含鈣離子結(jié)合位點(diǎn)多肽Ⅰ點(diǎn)樣處無陽性信號。 (2)正常血漿與兔血清(0ul，10ul，40ul，80ul)混合孵育，加入CaCl_2溶液后，4管均有血漿纖維蛋白凝塊形成，大小基本相同，再加入5M尿素溶液1h后，第1管纖維蛋白凝塊基本無變化，而第2，3，4管均有不同程度的縮小，且縮小的程度依抗血清量的增加依次遞增。 2．(1)用純化的人FXⅢ蛋白、正常血漿電泳轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜上，當(dāng)用制備的抗血清作一抗、用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG作二抗，在82.5KD的位置均有陽性信號，而FXⅢ缺乏病例1血漿在82.5KD的位置處有較弱的陽性信號，F(xiàn)XⅢ缺乏病例2血漿在82.5KD的位置處沒有陽性信號。 (2)以FXⅢ缺乏病例1血清孵育后，再加兔血清孵育過夜的PVDF膜在含轉(zhuǎn)氨酶活性位點(diǎn)多肽Ⅱ點(diǎn)樣處出現(xiàn)陽性信號；純化的人FXⅢ和含鈣離子結(jié)合位點(diǎn)多肽Ⅰ點(diǎn)樣處均無陽性信號。而以FXⅢ缺乏病例2血清孵育后，再加兔血清孵育過夜的PVDF膜在純化的FXⅢ、含鈣離子結(jié)合位點(diǎn)多肽Ⅰ、含轉(zhuǎn)氨酶活性位點(diǎn)多肽Ⅱ點(diǎn)樣處均未見陽性信號。 結(jié)論： 1．用免疫動物法成功制備了針對FXⅢA亞單位轉(zhuǎn)氨酶活性位點(diǎn)的兔抗人多克隆抗體，此抗體不僅可特異性與純化的人FXⅢ及含轉(zhuǎn)氨酶活性位點(diǎn)多肽結(jié)合，而且在體外可以抑制人FXⅢ活性。 2．應(yīng)用此抗體可檢測FXⅢ缺乏，且分析出FXⅢ缺乏病例2的血漿中FXⅢ抑制物作用位點(diǎn)為轉(zhuǎn)氨酶活性位點(diǎn)，而FXⅢ缺乏病例1的血漿中FXⅢ抑制物作用位點(diǎn)不是轉(zhuǎn)氨酶活性位點(diǎn)。
[Abstract]:Objective: to prepare and identify the polyclonal antibody of FX 鈪

本文編號：2429553