【摘要】： 目的 免疫避孕與免疫不孕是生殖研究領(lǐng)域的兩大重要課題，尋找合適的精子膜抗原是解決這兩個問題的關(guān)鍵所在。精子膜抗原與受精和胚胎的早期發(fā)育有密切關(guān)系，其中部分抗原能引起機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，導(dǎo)致免疫性不孕。 人精子頂體膜相關(guān)蛋白32(Human Sperm Acrosomal Membrane-Associated Protein32，hSAMP32)hSAMP32cDNA(complement DNA)長度1455bp，基因定位于6q15-16.2，編碼294個氨基酸，分子量32KDa，等電點(diǎn)4.57。hSAMP32的組織定位具有睪丸特異性，分布于精子頂體赤道區(qū)及頂體內(nèi)膜。hSAMP32在精卵結(jié)合以及精卵融合過程中發(fā)揮重要作用，是導(dǎo)致免疫不孕眾多因素之一。 基因疫苗是二十世紀(jì)九十年代發(fā)展起來的一種新型疫苗，它是指將編碼特定抗原的基因克隆到合適的質(zhì)粒載體上，制備成核酸表達(dá)載體，通過肌肉注射、腹腔注射等方法將其導(dǎo)入宿主機(jī)體，通過宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成抗原蛋白質(zhì)，從而激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答，所以又被稱為核酸疫苗或基因疫苗�；蛞呙缇哂忻庖叱掷m(xù)時間長、制備、攜帶方便、價廉等優(yōu)點(diǎn)，它在免疫避孕方面的應(yīng)用促進(jìn)了避孕疫苗的發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)選擇hSAMP32為靶基因，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)克隆出人hSAMP32cDNA，再以真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)為載體構(gòu)建hSAMP32避孕疫苗，為進(jìn)一步研究開發(fā)避孕疫苗奠定基礎(chǔ)。 方法 1．逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)擴(kuò)增hSAMP32基因片段：根據(jù)GenBank(AF203447)報道的hSAMP32基因序列設(shè)計一對引物，在引物的5’端加上BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)，以便插入pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體。提取人睪丸組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，，PCR擴(kuò)增目的基因片段。 2．hSAMP32基因測序：瓊脂糖電泳，回收目的條帶，同T載體連接。轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1菌株，氨芐青霉素(Amp)和藍(lán)白斑篩選。挑選白色菌落，進(jìn)行菌落PCR鑒定和雙酶切鑒定，送TaKaRa公司測序。 3．重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-hSAMP32的構(gòu)建：將克隆至PGEM-T載體的hSAMP32基因片段用BamHI和XhoI雙酶切后，連接到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中，PCR及雙酶切鑒定。 4．動物實(shí)驗(yàn)：用基因槍技術(shù)把重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)—hSAMP32導(dǎo)入BALB／c小鼠股四頭肌部位，觀察BALB／c小鼠生殖能力是否受到影響。 5．體外表達(dá)：將hSAMP32基因片段連接到原核表達(dá)載體PGEX-4T3構(gòu)建成重組質(zhì)粒PGEX-4T3—hSAMP32，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。 結(jié)果 1．RT-PCR擴(kuò)增片段電泳結(jié)果：PCR擴(kuò)增出一條882bp條帶，測序結(jié)果與GenBank(AF203447)報道的基因序列一致。 2．pcDNA3.1(+)—hSAMP32重組質(zhì)粒鑒定：雙酶切產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖電泳后，在Marker882bp對應(yīng)處出現(xiàn)目的條帶。 3．動物實(shí)驗(yàn)：hSAMP32目的基因組BALB／c小鼠2次基因槍轟擊后妊娠率與對照組相比明顯下降，同時用鼠抗hSAMP32血清做穿卵實(shí)驗(yàn)明顯降低精子穿卵率。 4．體外表達(dá)：重組質(zhì)粒PGEX-4T3-hSAMP32轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE分析顯示：PGEX-4T3—hSAMP32表達(dá)分子量為59KDa的蛋白條帶與預(yù)期蛋白分子量理論值一致。 結(jié)論 1．成功構(gòu)建了pcDNA3.1(+)-hSAMP32重組質(zhì)粒。 2．基因槍介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染法能夠高效將pcDNA3.1(+)—hSAMP32基因疫苗轉(zhuǎn)染到小鼠骨骼肌中。 3．重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)—hSAMP32作為避孕疫苗能明顯降低小鼠受孕率。
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【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R392;R169.42

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2428016