【摘要】：目的：誘導(dǎo)泡球蚴Em18重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)，優(yōu)化Em18重組蛋白的純化方法，將純化的重組蛋白作為抗原，制備泡球蚴Em18抗原的多克隆抗血清，為進(jìn)一步運(yùn)用噬菌體表面抗原展示技術(shù)，篩選Em18抗原表位奠定基礎(chǔ)。方法：將重組表達(dá)載體pET41a-Em18轉(zhuǎn)化導(dǎo)入BL21(E．coli)中。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，對表達(dá)產(chǎn)物用SDS-PAGE進(jìn)行分析，鑒定表達(dá)蛋白的大小。采用超聲破碎程序破碎重組大腸桿菌細(xì)胞，加入蛋白酶抑制劑組合，分別用Glutathione Sepharose-4B親合層析柱、His-Bind-Ni resin及兩者結(jié)合方法，改變不同的平衡、洗滌和洗脫緩沖液濃度，純化rEm18-GST重組蛋白，并篩選和優(yōu)化了泡球蚴Em18重組蛋白在大腸桿菌中表達(dá)和純化的方法。純化后的蛋白用SDS-PAGE鑒定。將純化后的Em18-GST作為抗原免疫BALB／c小鼠。制備鼠源抗Em18多克隆抗體，用ELISA和Western印跡分析方法鑒定其特異性。結(jié)果：①SDS-PAGE檢測表明，，Em18-GST重組蛋白得到成功表達(dá)，在相對分子量為50kDa處有表達(dá)條帶。②在超聲程序?yàn)椋汗ぷ?s，間歇3s，每個(gè)循環(huán)時(shí)程為10min，加入蛋白酶抑制劑組合，可降低目的蛋白的降解，得到高濃度的rEm18-GST可溶性蛋白；③通過對三種純化方法的對比和對平衡、洗滌和洗脫緩沖液濃度等條件的優(yōu)化組合，采用單純His柱，獲得回收量高，純度高的rEm18-GST重組蛋白。④ELISA結(jié)果表明，抗Em18抗血清的抗體滴度為1：25600；Western-blot結(jié)果表明抗Em18抗血清能與Em18-GST
[Abstract]:Objective: to induce the expression of Em18 recombinant protein in Escherichia coli, optimize the purification method of Em18 recombinant protein, and use the purified recombinant protein as antigen to prepare the polyclonal antiserum of Em18 antigen of hydatid alveolar hydatid. The results laid a foundation for the screening of Em18 epitopes by using phage surface antigen display technique. Methods: the recombinant expression vector pET41a-Em18 was transformed into BL21 (E.coli). After IPTG induction, the expressed product was analyzed by SDS-PAGE, and the size of the expressed protein was identified. Recombinant Escherichia coli cells were broken by ultrasonic fragmentation procedure, and protease inhibitor combination was added to change the balance by Glutathione Sepharose-4B affinity chromatography column, His-Bind-Ni resin and the combination of the two methods, respectively. The rEm18-GST recombinant protein was purified by washing and eluting buffer concentration, and the method of expression and purification of Em18 recombinant protein in E. coli was screened and optimized. The purified protein was identified by SDS-PAGE. Purified Em18-GST was used as antigen to immunize BALB/c mice. Mouse anti-Em18 polyclonal antibodies were prepared and identified by ELISA and Western blot analysis. Results: 1SDS-PAGE analysis showed that the recombinant Em18-GST protein was successfully expressed, and there were bands at the relative molecular weight of 50kDa. 2 in the ultrasound program: 1 s, intermission 3 s, each cycle time was 10 min, and the protease inhibitor combination was added. The degradation of target protein was reduced and high concentration of rEm18-GST soluble protein was obtained. 3 through the comparison of three purification methods and the optimized combination of equilibrium, washing and elution buffer concentration, rEm18-GST recombinant protein with high recovery amount and high purity was obtained by using simple His column. The titer of anti Em18 antiserum was 1: 25600; The results of Western-blot showed that the antiserum against Em18 could be associated with Em18-GST.
【學(xué)位授予單位】：新疆醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R392

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本文編號：2424120