【摘要】： 目的:觀察開(kāi)放型拉細(xì)麥管、閉合型拉細(xì)麥管、冷凍環(huán)和麥管四種冷凍容器對(duì)玻璃化凍融胚胎形態(tài)和功能的影響。 方法: 1、將人三原核受精卵發(fā)育形成的300個(gè)6-10細(xì)胞胚胎隨機(jī)分為五組:對(duì)照組60個(gè)、麥管組(Straw)、開(kāi)放型拉細(xì)麥管組(open pulled straw, OPS)、閉合型拉細(xì)麥管組(close pulled straw, CPS)和冷凍環(huán)(Cryoloop)各60個(gè)。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察,比較胚胎復(fù)蘇后存活率。 2、收集凍融胚胎培養(yǎng)24h的培養(yǎng)液,全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定培養(yǎng)液中的乳酸脫氫酶(LDH)活性。 結(jié)果: 1、Cryoloop超速玻璃化冷凍胚胎存活率最高,與CPS、OPS和Straw相比,差異具有顯著性(P0.05);CPS與OPS和Straw相比,胚胎存活率有明顯差異(P0.05)。 2、Cryoloop組LDH低于CPS、OPS和Straw三實(shí)驗(yàn)組,差異具有顯著性(P0.05); CPS組LDH低于OPS和Straw兩超速玻璃化冷凍組(P0.05);Straw組LDH最高,但與OPS組相比,差異無(wú)顯著性(P0.05)。 結(jié)論:Cryoloop對(duì)玻璃化凍融胚胎的形態(tài)和功能影響最小,CPS次之,OPS雖未獲得比Straw更高的形態(tài)存活率,但減輕了對(duì)胚胎的功能損傷。 第二部分氯化膽堿替代氯化鈉的磷酸鹽緩沖液和非滲透性冷凍保護(hù)劑海藻糖對(duì)胚胎玻璃化冷凍的影響 目的:觀察低Na+磷酸鹽緩沖液(mPBS)和非滲透性冷凍保護(hù)劑海藻糖(Trehalose)對(duì)胚胎玻璃化冷凍的影響。 方法: 1、將180個(gè)人三原核6-10細(xì)胞胚胎隨機(jī)分為三組,對(duì)照組、mPBS組和PBS組。用氯化膽堿(choline chloride)代替磷酸鹽緩沖液中的氯化鈉(NaCl),配制成改良的低鈉磷酸鹽緩沖液(mPBS)。再以mPBS和PBS為母液配制玻璃化冷凍液凍融胚胎。比較胚胎存活率;收集凍融胚胎培養(yǎng)24h的培養(yǎng)液,全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定培養(yǎng)液中的乳酸脫氫酶(LDH)活性并進(jìn)行比較。 2、將180個(gè)人三原核6-10細(xì)胞胚胎隨機(jī)分為三組,對(duì)照組、海藻糖(D-(+)Trehalose)組和蔗糖(Sucrose)組。分別用海藻糖和蔗糖為非滲透性冷凍保護(hù)劑,配制玻璃化冷凍復(fù)蘇液凍融胚胎。比較胚胎存活率;收集凍融胚胎培養(yǎng)24h的培養(yǎng)液,全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定培養(yǎng)液中的乳酸脫氫酶(LDH)活性并進(jìn)行比較。 結(jié)果: 1、mPBS組胚胎存活率略高于磷酸鹽緩沖液組,但無(wú)顯著性差異(P0.05);mPBS組LDH活性低于PBS組,差異具有顯著性(P0.05)。 2、D-(+)Trehalose組胚胎存活率略高于Sucrose組,但無(wú)顯著差異(P0.05);D-(+)Trehalose組LDH活性低于Sucrose組,亦無(wú)顯著差異(P0.05)。 結(jié)論: 1、低Na+磷酸鹽緩沖液對(duì)玻璃化冷凍胚胎的功能影響小,更適于玻璃化冷凍胚胎。 2、D-(+)Trehalose與Sucrose相比,未能顯著增加凍融胚胎的存活率,亦未明顯減輕對(duì)胚胎功能的影響。 第三部分玻璃化冷凍胚胎的退化機(jī)制研究 目的:探討玻璃化冷凍胚胎的退化機(jī)制。 方法: 1、將人三原核受精卵發(fā)育形成的150個(gè)6-10細(xì)胞胚胎隨機(jī)分為五組:對(duì)照組、Cryoloop組、Straw組、OPS組和CPS組各30個(gè)。經(jīng)羅丹明123 (Rhodamine123,Rh123)染色后在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察并攝片分析熒光強(qiáng)度。 2、將人三原核受精卵發(fā)育形成的158個(gè)6-10細(xì)胞胚胎隨機(jī)分為三組:陽(yáng)性對(duì)照組30個(gè),正常組30個(gè),CPS超速玻璃化冷凍組98個(gè)。將對(duì)照組和復(fù)蘇后存活胚胎置于含4%多聚甲醛的PBS固定液中固定,按照TUNEL(脫氧核甘酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧尿嘧啶缺口末端標(biāo)記法)試劑盒說(shuō)明將固定好的胚胎進(jìn)行標(biāo)記和熒光顯色,原位檢測(cè)DNA裂解片斷的存在。激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)下觀察并攝片。 結(jié)果: 1、對(duì)照組正常胚胎的△Ψm穩(wěn)定在22.2622±0.67067;凍融胚胎的熒光強(qiáng)度較正常胚胎減弱,△Ψm降低;四玻璃化冷凍組間的胚胎熒光強(qiáng)度亦不等,其中Cryoloop組熒光強(qiáng)度最強(qiáng),△Ψm最高,與對(duì)照組相比,無(wú)顯著性差異(P㧐0.05);CPS與OPS兩超速玻璃化冷凍組凍融胚胎的△Ψm高于Straw組(P㩳0.05);CPS和OPS兩組比較,無(wú)明顯差異(P㧐0.05); CPS、OPS和Straw三冷凍組△Ψm均低于對(duì)照組,且具顯著性差異 2、經(jīng)TUNEL染色,陽(yáng)性對(duì)照組胚胎全都有綠色熒光表達(dá);正常組胚胎僅6.9%胚胎的有綠色熒光的表達(dá);CPS超速玻璃化冷凍胚胎的表達(dá)較正常胚胎明顯增多( 29.1% 6.9% ,P0.05)。 結(jié)論:LSCM檢測(cè)到了玻璃化冷凍胚胎的△Ψm下降,而TUNEL法在玻璃化凍融胚胎中檢測(cè)到了DNA裂解片斷的存在,結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察,證實(shí)了玻璃化冷凍胚胎通過(guò)細(xì)胞凋亡途徑退化。 第四部分激光掃描共聚焦顯微鏡結(jié)合免疫細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)在玻璃化冷凍小鼠卵母細(xì)胞中的研究應(yīng)用 目的:建立一種觀察成熟卵母細(xì)胞紡錘體和染色體的方法,并用于觀察OPS玻璃化冷凍成熟(MⅡ期)卵母細(xì)胞的紡錘體和染色體變化 方法: 1、運(yùn)用激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)的光學(xué)切片和三維圖像重建技術(shù),結(jié)合懸浮細(xì)胞的免疫化學(xué)方法,觀察小鼠MII期卵母細(xì)胞的紡錘體和染色體。 2、采集小鼠的MⅡ期卵母細(xì)胞, OPS法超速玻璃化冷凍,復(fù)蘇后存活卵母細(xì)胞經(jīng)固定、免疫細(xì)胞化學(xué)染色后,LSCM觀察其紡錘體和染色體;采集小鼠的MⅡ期卵母細(xì)胞和精子,卵母細(xì)胞行OPS法玻璃化冷凍,復(fù)蘇后行體外受精并繼續(xù)培養(yǎng)至囊胚。 結(jié)果: 1、應(yīng)用LSCM清晰地觀察到了成熟卵母細(xì)胞紡錘體和染色體的形態(tài),紡錘體和染色體的正常率分別為82%和86%。 2、OPS玻璃化冷凍卵母細(xì)胞復(fù)蘇后紡錘體和染色體形態(tài)正常率分別為46%和52%,與對(duì)照組(76%和70%)相比,具顯著性差異(P0.05);OPS玻璃化凍融胚胎的存活率、受精率和囊胚形成率分別為58%、36%和19.3%。 結(jié)論: 1、LSCM結(jié)合細(xì)胞免疫化學(xué)能夠清晰有效地觀察MⅡ期卵母細(xì)胞的紡錘體和染色體。 2、LSCM結(jié)合細(xì)胞免疫化學(xué)觀察到了OPS玻璃化冷凍卵母細(xì)胞紡錘體和染色體的損傷,進(jìn)一步證實(shí)了該方法可作為觀察MⅡ期卵母細(xì)胞紡錘體和染色體的可靠手段;OPS超速玻璃化冷凍卵母細(xì)胞具有一定的可行性。
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【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類(lèi)號(hào)】：R318.52;R321-33

【引證文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2417694