【摘要】： 目的： 晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)是一組在體內(nèi)糖的醛基與蛋白質(zhì)的氨基之間發(fā)生的非酶性糖基化反應(yīng)的終產(chǎn)物的總稱。有研究證明：AGEs在糖尿病血管并發(fā)癥、動(dòng)脈硬化、腎病、老年性癡呆癥以及衰老的發(fā)生發(fā)展起重要的作用，而血管通透性升高則是AGEs所致血管病變的早期和主要的病理生理基礎(chǔ)。然而，參與其中的機(jī)制尚未完全闡明。一般情況下，血管通透性的調(diào)節(jié)主要是通過(guò)細(xì)胞間連接以及細(xì)胞—基質(zhì)間的錨定作用和內(nèi)皮細(xì)胞自身的收縮產(chǎn)生的向心力間的動(dòng)態(tài)平衡來(lái)實(shí)現(xiàn)的。自身收縮力增大或連接破壞都會(huì)引起血管通透性升高。內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接(tight junction，TJ)是由多種跨膜蛋白[包括咬合蛋白(occludin)、閉合蛋白(claudin-1、claudin-2、claudin-5)]、TJ相關(guān)膜周邊蛋白[包括胞質(zhì)帶狀閉合蛋白(ZO-1、ZO-2、ZO-3)，扣帶蛋白(cingulin)，rab13等]和連接黏附分子(junctional adhesion molecule，JAM)等組成的復(fù)合物。相鄰細(xì)胞膜表面occludin和claudin各自同型間相互密切結(jié)合，這兩種蛋白又通過(guò)包括ZO-1在內(nèi)的周邊蛋白與肌動(dòng)蛋白相作用，形成閉鎖的細(xì)胞間連接。細(xì)胞間連接的解離會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞間隙的形成，從而引起內(nèi)皮通透性的升高。本課題的研究目的是探討AGEs對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接ZO-1和纖維狀肌動(dòng)蛋白(Filamentous actin，F(xiàn)-actin)的形態(tài)學(xué)影響，并對(duì)其作用機(jī)制作初步研究，為相關(guān)疾病的發(fā)生機(jī)制提供更系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，，為臨床治療提供新的思路。 方法： 培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，用免疫熒光染色的方法顯示ZO-1和F-actin在內(nèi)皮細(xì)胞分布的形態(tài)和部位。AGE修飾的人血清白蛋白(AGE-modified human serum albumin，AGE-HSA)，由人血清白蛋白與葡萄糖共孵育8周制得。觀察AGE-HSA以不同濃度(12.5、25、50、100 mg／L)和不同時(shí)間(2、4、8、24 h)作用下，內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1和F-actin的形態(tài)學(xué)變化，查明AGEs引起內(nèi)皮細(xì)胞ZO-1和F-actin形態(tài)改變的劑量和時(shí)間效應(yīng)。通過(guò)選用Rho激酶的特異性抑制劑Y-27632探討Rho激酶在AGEs誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞ZO-1和F-actin形態(tài)改變中的作用。分別使用ERK通路抑制劑PD98059、p38 MAPK通路抑制劑SB203580預(yù)處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；另外分別使用相關(guān)特異蛋白突變體重組腺病毒轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞，來(lái)探討ERK通路和p38 MAPK通路在AGEs介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞ZO-1和F-actin形態(tài)學(xué)變化中發(fā)揮的作用。以上變化通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和免疫印跡(Western blot)的方法檢測(cè)AGEs刺激內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)ERK和p38 MAPK磷酸化的水平的影響，為形態(tài)學(xué)結(jié)果提供進(jìn)一步證明。 結(jié)果： 1．正常對(duì)照組的內(nèi)皮細(xì)胞ZO-1存在于細(xì)胞周邊呈環(huán)狀，線條清晰連續(xù)，邊緣光滑流暢。AGEs作用于內(nèi)皮細(xì)胞引起ZO-1形態(tài)的明顯變化，ZO-1環(huán)線條變得模糊，呈斷裂狀，邊緣粗糙有毛刺狀突起，細(xì)胞內(nèi)染色增多，且這種變化的程度隨著AGEs作用濃度的增加(12.5-100 mg／L)和作用時(shí)間的延長(zhǎng)(2-24 h)逐漸加深。其中以50 mg／L AGEs作用細(xì)胞8 h變化最為明顯。正常條件下F-actin分布在細(xì)胞周邊形成actin環(huán)，結(jié)構(gòu)緊密，邊界清晰，細(xì)胞間無(wú)間隙。AGEs作用于內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致actin環(huán)出現(xiàn)斷裂，細(xì)胞界限模糊，此變化的程度亦隨AGEs作用濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸加強(qiáng)。 2．用Rho激酶抑制劑Y27632預(yù)處理細(xì)胞30 min后，可明顯降低AGEs對(duì)緊密連接蛋白ZO-1和F-actin分布和形態(tài)的影響。 3．分別用ERK通路抑制劑(PD98059)或p38 MAPK通路抑制劑(SB203580)預(yù)處理細(xì)胞30 min后，均可顯著減輕AGEs對(duì)ZO-1和F-actin的影響。 4．分別以含顯性失活(dominant negative，DN)的ERK上游激酶MEK1或p38 MAPK上游激酶MEK6b的重組腺病毒預(yù)先轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞12 h，均可減輕AGEs對(duì)緊密連接蛋白ZO-1和F-actin分布和形態(tài)的影響；而含組成型激活(constitutive active，CA)MEK1或MEK6b突變體的重組腺病毒本身作用細(xì)胞即可引起內(nèi)皮細(xì)胞ZO-1和F-actin分布和形態(tài)的變化。 5．Western blot研究結(jié)果顯示，50 mg／LAGEs刺激細(xì)胞8h能引起內(nèi)皮細(xì)胞p38 MAPK磷酸化水平的升高。用Rho激酶抑制劑Y-27632預(yù)處理細(xì)胞30 min后，可降低AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞p38 MAPK磷酸化水平的升高。 結(jié)論： 1．實(shí)驗(yàn)證明，AGEs以劑量和時(shí)間依賴的方式引起內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1和F-actin形態(tài)和分布改變。 2．Rho激酶參與了AGEs引起的內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1和F-actin形態(tài)和分布的改變。 3．AGEs刺激可以引起內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1和F-actin形態(tài)和分布改變，這一作用可能是由ERK及p38 MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)的。 4．AGEs可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞p38 MAPK激活，而Rho激酶抑制劑Y-27632預(yù)處理細(xì)胞，可降低AGEs引起內(nèi)皮細(xì)胞p38 MAPK磷酸化水平的升高，說(shuō)明Rho激酶可能在p38 MAPK通路上游發(fā)揮作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R361

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本文編號(hào)：2411856