【摘要】： 目的(1)通過小鼠成熟卵母細(xì)胞慢速冷凍實驗,探討冷凍液中不同的蔗糖濃度對小鼠成熟卵母細(xì)胞冷凍效果的影響;探討不同體外培養(yǎng)時間對小鼠復(fù)蘇后的卵母細(xì)胞受精和胚胎發(fā)育情況的影響;初步試驗輔助激活方法補(bǔ)救復(fù)蘇后單精子卵胞漿內(nèi)顯微注射(ICSI)受精失敗的卵母細(xì)胞的可行性。(2)通過人成熟卵母細(xì)胞的慢速冷凍實驗,比較冷凍液中不同的蔗糖濃度對人類卵母細(xì)胞慢速冷凍效果的價值;(3)采用免疫熒光染色方法,通過激光共聚焦顯微鏡觀察人類成熟卵母細(xì)胞冷凍前后、復(fù)蘇后不同時間內(nèi)紡錘體和染色體形態(tài)學(xué)變化;探討冷凍和體外培養(yǎng)時間對人類卵母細(xì)胞第二次減數(shù)分裂時期紡錘體和染色體的影響,為人類成熟卵母細(xì)胞凍融方法的改進(jìn)和后期發(fā)育結(jié)局的改善提供實驗依據(jù)。 方法(1) 30只清潔級成年健康昆明小白鼠,進(jìn)行控制性超促排卵(COH)后獲取小鼠成熟卵母細(xì)胞,比較冷凍液中不同蔗糖濃度(0.2mol/l蔗糖vs0.3mol/l蔗糖)的冷凍效果;(2)復(fù)蘇后存活良好的卵母細(xì)胞培養(yǎng)不同的時間(1h、2h、3h、4h、5h)行ICSI,觀察受精和胚胎發(fā)育情況;比較新鮮和解凍后ICSI受精失敗的卵母細(xì)胞采用Ca2+載體離子霉素聯(lián)合嘌呤霉素輔助激活的效果。(3)人成熟卵母細(xì)胞124枚隨機(jī)分為兩組行慢速程序化冷凍,冷凍液中分別采用0.2mol/l蔗糖和0.3mol/l蔗糖,了解兩組凍融后的存活情況;(4)兩組存活良好、外觀形態(tài)正常的64枚卵母細(xì)胞,隨機(jī)分為3組,分別體外培養(yǎng)不同的時間(1h、3h、5h)后固定熒光染色,同時用18枚新鮮的人成熟卵母細(xì)胞熒光染色作為對照組,在激光共聚焦顯微鏡下觀察紡錘體和染色體的形態(tài)。 結(jié)果(1) 0.2mol/l蔗糖組和0.3mol/l蔗糖組相比,小鼠成熟卵母細(xì)胞凍融后存活率分別為60.5%、80.7%,兩組相比有顯著差異性(P0.05);復(fù)蘇后小鼠卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)不同的時間(1h、2h、3h、4h、5h),結(jié)果顯示培養(yǎng)3h、4h組的卵母細(xì)胞正常受精率、囊胚形成率和培養(yǎng)1h、2h組結(jié)果相比有明顯差異(p 0.05) ;3h、4h兩組之間正常受精率和囊胚形成率相比無統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05);培養(yǎng)1h、2h兩組結(jié)果相比,無統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05);培養(yǎng)5h組中部分卵母細(xì)胞ICSI前已經(jīng)發(fā)生卵裂,其剩余卵母細(xì)胞正常受精率和囊胚形成率和其它組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05) ;幾組正常受精后的胚胎卵裂率無統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。采用Ca2+載體離子霉素聯(lián)合嘌呤霉素輔助激活解凍后ICSI受精失敗的卵母細(xì)胞,凍融組卵母細(xì)胞激活率明顯低于新鮮組(30.4%vs71.1%,p 0.05),凍融組有一枚激活的卵母細(xì)胞發(fā)育至囊胚。(2)人成熟卵母細(xì)胞采用慢速程序冷凍方法,冷凍液中采用0.2mol/l蔗糖和0.3mol/l蔗糖,存活率分別為56.5%、80.6%,兩組相比有明顯差異性(P0.01)。復(fù)蘇后存活良好的人卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)不同的時間(a組:1h、b組:3h、c組:5h)固定熒光染色,三組凍融后的卵母細(xì)胞紡錘體正常比例明顯低于對照組新鮮卵母細(xì)胞(10.0% vs 83.3%,P0.05; 45.5% vs 83.3%, P0.05; 40.9% vs 83.3%, P0.05);a組紡錘體的缺失率明顯高于對照組(45.0% vs 5.6%, p 0.5)。在凍融后的卵母細(xì)胞中,a組分別和b組、c組相比,紡錘體正常比例明顯下降(10.0% vs 45.5%, p 0.05; 10.0% vs 40.9%, P0.05);紡錘體缺失率明顯增高(45.5% vs 13.6%, p 0.05; 45.5% vs 13.6%, P0.05)。b、c兩組紡錘體觀察結(jié)果相比無明顯差異。a組與b組、c組和對照組三組相比,正常染色體率明顯降低(30.0% vs 68.2%,p 0.05; 30.0% vs 63.6%, P0.05; 30.0% vs 77.8%, P0.05)。b組、c組、對照組三組染色體觀察結(jié)果相比,無明顯差異(p0.05)。 結(jié)論(1)慢速冷凍小鼠成熟卵母細(xì)胞,CPA中0.3mol/l蔗糖較0.2mol/l蔗糖可以明顯提高凍融后卵母細(xì)胞存活率;復(fù)蘇后的小鼠卵母細(xì)胞ICSI前培養(yǎng)3～4h可以提高正常受精、胚胎分裂能力。用Ca~(2+)載體離子霉素聯(lián)合嘌呤霉素的輔助激活方法,可能會使復(fù)蘇后受精失敗的卵母細(xì)胞獲得正常受精和繼續(xù)發(fā)育的希望,但由于凍融過程對卵母細(xì)胞的損傷,與ICSI受精失敗的新鮮卵母細(xì)胞相比,復(fù)蘇后受精失敗的卵母細(xì)胞被補(bǔ)救激活的能力明顯下降。(2)慢速冷凍人類成熟卵母細(xì)胞,適當(dāng)提高CPA中蔗糖濃度同樣可以明顯提高存活率;采用免疫熒光染色和激光共聚焦顯微技術(shù)(CLSM)可以對單個卵母細(xì)胞的紡錘體和染色體結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察;慢速冷凍對人類成熟卵母細(xì)胞紡錘體和染色體有一定程度的損傷,復(fù)蘇后培養(yǎng)適當(dāng)?shù)臅r間可以促進(jìn)部分卵母細(xì)胞紡錘體和染色體形態(tài)的恢復(fù)。
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【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R318.52;R321

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2404759