【摘要】： 疫苗是使用最廣泛的藥物之一,不僅使天花、瘧疾等某些烈性傳染病得到有效的控制或消滅,而且還被應(yīng)用于腫瘤、自身免疫病、免疫缺陷、超敏反應(yīng)等疾病的預(yù)防和治療。新型疫苗是采用基因工程技術(shù)和生物化學(xué)合成技術(shù)生產(chǎn)的,包括裸DNA疫苗、重組蛋白類疫苗、合成肽疫苗、重組病毒和細(xì)菌疫苗等。 我國一直未要求對疫苗類藥物進(jìn)行全面的臨床前毒理學(xué)研究,國際上對于疫苗的臨床前安全性研究也處于探索階段。采用何種方法研究疫苗的毒性,特別是免疫毒性一直是困擾人們的課題。為解決我國不斷研制的新型疫苗在進(jìn)入臨床和市場前的安全性研究問題,本文選擇了我國獨立研發(fā)的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的三種新型疫苗—熱休克蛋白-多肽復(fù)合物腫瘤疫苗(重組熱休克蛋白65-MUC1融合蛋白腫瘤疫苗,HSP65-MUC1)、HIV DNA疫苗(DNA疫苗)和HIV重組痘病毒載體疫苗(痘苗)作為研究對象(其中,包括以DNA疫苗和重組痘病毒載體HIV疫苗組成的復(fù)合疫苗),對其進(jìn)行了免疫毒性、一般毒性以及DNA疫苗和病毒載體疫苗的生物分布研究,目的是為找出不同疫苗毒理學(xué)研究中的共性問題及特性問題,建立相應(yīng)的研究方法和研究體系。 在本研究采用的免疫毒性檢測的方法包括:(1)免疫相關(guān)組織器官的宏觀和微觀病理學(xué)檢查;(2)非放射性CFSE染色法檢測淋巴細(xì)胞功能(3),巨噬細(xì)胞功能檢查(4)流式細(xì)胞法對不同亞型淋巴細(xì)胞數(shù)量的測定(5)ELISA檢測體液免疫;(6)ELISA法、細(xì)胞內(nèi)染色法、ELISPOT法檢測T細(xì)胞免疫(細(xì)胞因子的產(chǎn)生)。本研究對DNA疫苗和病毒載體疫苗建立了實時定量PCR法檢測其DNA生物分布。一般毒性研究檢測疫苗對機(jī)體本身的宏觀毒性反應(yīng),方法包括:血液學(xué)和血清生化學(xué)檢查、大體和組織病理學(xué)檢查、體重、攝食量、臨床癥狀的觀察等。 HSP65-MUC1毒性的研究包括:C57BL/6小鼠單次給藥毒性研究、C57BL/6小鼠反復(fù)給藥毒性研究、恒河猴反復(fù)給藥毒性研究。以臨床研究擬用給藥次數(shù)為“n”,小鼠試驗采用“n+1”次給藥,恒河猴采用“n+4”次給藥。研究內(nèi)容包括免疫毒性和一般毒性。DNA疫苗的研究包含在復(fù)合疫苗的毒性研究中,采用BALB/c小鼠反復(fù)給藥研究,完全模擬臨床“3針DNA疫苗prime-1針病毒載體疫苗boost”的給藥方案。研究內(nèi)容包括免疫毒性、一般毒性和生物分布研究。痘苗毒性研究采用BALB/c小鼠,采用“n”次給藥和“n+1”次給藥2種組合,研究內(nèi)容包括免疫毒性、一般毒性和生物分布研究。 本研究中3種疫苗主要的毒性研究結(jié)果為:(1)在小鼠和恒河猴未見與HSP65-MUC1有關(guān)的全身毒性反應(yīng)和免疫毒性反應(yīng);HSP65-MUC1可以誘導(dǎo)較強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。(2)DNA疫苗和痘苗的毒性反應(yīng)包括主要由痘苗引起的注射部位可逆性的局部刺激反應(yīng)、以及部分血液學(xué)指標(biāo)可逆性的變化;復(fù)合疫苗與兩種組分分別單獨使用相比,可以誘導(dǎo)較強(qiáng)的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。(3)組織分布研究發(fā)現(xiàn)DNA疫苗和痘苗在體內(nèi)不會廣泛分布、也不會長期殘留。 本研究初步建立了關(guān)于疫苗毒理學(xué)研究的主要方法和研究體系,包括(1)建立了疫苗免疫毒性檢測的方法和體系:免疫相關(guān)組織器官的宏觀和微觀病理學(xué)檢查;建立了非放射性CFSE染色法檢測淋巴細(xì)胞功能的方法,采用亞型測定檢測淋巴細(xì)胞數(shù)量;檢測體液免疫和細(xì)胞免疫以考察相關(guān)的免疫毒性。(2)建立了免疫原性(體液免疫)和細(xì)胞免疫的監(jiān)測方法。在不同的時間點監(jiān)測毒性指標(biāo),便于捕捉到毒性最敏感的時期。(3)建立了3種不同的檢測T細(xì)胞免疫反應(yīng)(γ-IFN水平)的方法:ELISA檢測細(xì)胞上清中γ-IFN水平,操作最簡便,但檢測靈敏毒最低,在本文腫瘤疫苗的細(xì)胞免疫檢測種,效果不是很明顯;細(xì)胞內(nèi)染色后流式細(xì)胞法檢測特定T細(xì)胞產(chǎn)生γ-IFN的能力,該方法操作較簡單,且比ELISA方法靈敏;ELISPOT法檢測單細(xì)胞水平產(chǎn)生γ-IFN的能力,該方法操作復(fù)雜,但靈敏度高,可以用來檢測T細(xì)胞反應(yīng)不強(qiáng)的疫苗,但因操作過程復(fù)雜,需要嚴(yán)格控制試驗條件,否則會導(dǎo)致個體差異大。(4)建立了DNA疫苗和重組病毒載體疫苗的組織分布實時定量PCR檢測方法。這是該類產(chǎn)品必須進(jìn)行的研究項目,既可以得到疫苗的體內(nèi)過程的信息,也可以初步預(yù)測DNA疫苗的整合風(fēng)險。(5)通過HSP65-MUC1和痘苗的評價,驗證了“n+1”給藥次數(shù)的合理性,并且發(fā)現(xiàn)在腫瘤疫苗中“n+x”,即較多的給藥次數(shù)并未引起免疫耐受,可以為臨床的給藥方案提供參考。在“prime-boost”復(fù)合疫苗的毒性試驗設(shè)計方面,可以采用新的設(shè)計思路,如,壓縮研究周期、采用“n”次給藥方案(而不采用“n+1”)以及新的劑量設(shè)計方法。(6)由于疫苗的作用(體液或細(xì)胞免疫)通常比普通藥物維持時間長,應(yīng)該根據(jù)其免疫原性的特點設(shè)計較長的恢復(fù)期,通常為6～8周(普通藥物一般為2周)。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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1 梁昊宇;曾明;;新疫苗和佐劑的臨床前安全性評價[J];國際生物制品學(xué)雜志;2006年04期

2 梁昊宇;曾明;;新疫苗和佐劑的臨床前安全性評價(續(xù))[J];國際生物制品學(xué)雜志;2006年05期

3 龐樂君,刁天喜;痘病毒疫苗載體[J];國外醫(yī)學(xué)(藥學(xué)分冊);2004年03期

4 孫晗笑,劉杰;HIV感染的治療性DNA疫苗(綜述)[J];暨南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版);2001年06期

5 張儒蓮,彭朝華,饒懷廬;DNA疫苗的研究進(jìn)展[J];實用臨床醫(yī)學(xué);2005年10期

6 趙永亮,余佩武,蔡志民;熱休克蛋白與腫瘤的免疫治療[J];免疫學(xué)雜志;2003年S1期

7 王錦平,呂紅線,張偉;新型疫苗研究進(jìn)展[J];食品與藥品;2005年06期

8 鄧小玲;DNA疫苗激活CTL反應(yīng)機(jī)制及增強(qiáng)DNA疫苗效力的研究進(jìn)展[J];生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志;2003年01期

9 賀爭鳴,邢瑞昌,方喜業(yè),王祿增,尚昌連;論實驗動物福利、動物實驗與動物實驗替代方法[J];實驗動物科學(xué)與管理;2005年01期

10 原野;生物技術(shù)藥物臨床前安全性評價的進(jìn)展[J];衛(wèi)生毒理學(xué)雜志;2004年01期

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本文編號：2397686