【摘要】： 疫苗是使用最廣泛的藥物之一,不僅使天花、瘧疾等某些烈性傳染病得到有效的控制或消滅,而且還被應(yīng)用于腫瘤、自身免疫病、免疫缺陷、超敏反應(yīng)等疾病的預(yù)防和治療。新型疫苗是采用基因工程技術(shù)和生物化學(xué)合成技術(shù)生產(chǎn)的,包括裸DNA疫苗、重組蛋白類疫苗、合成肽疫苗、重組病毒和細(xì)菌疫苗等。 我國(guó)一直未要求對(duì)疫苗類藥物進(jìn)行全面的臨床前毒理學(xué)研究,國(guó)際上對(duì)于疫苗的臨床前安全性研究也處于探索階段。采用何種方法研究疫苗的毒性,特別是免疫毒性一直是困擾人們的課題。為解決我國(guó)不斷研制的新型疫苗在進(jìn)入臨床和市場(chǎng)前的安全性研究問(wèn)題,本文選擇了我國(guó)獨(dú)立研發(fā)的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的三種新型疫苗—熱休克蛋白-多肽復(fù)合物腫瘤疫苗(重組熱休克蛋白65-MUC1融合蛋白腫瘤疫苗,HSP65-MUC1)、HIV DNA疫苗(DNA疫苗)和HIV重組痘病毒載體疫苗(痘苗)作為研究對(duì)象(其中,包括以DNA疫苗和重組痘病毒載體HIV疫苗組成的復(fù)合疫苗),對(duì)其進(jìn)行了免疫毒性、一般毒性以及DNA疫苗和病毒載體疫苗的生物分布研究,目的是為找出不同疫苗毒理學(xué)研究中的共性問(wèn)題及特性問(wèn)題,建立相應(yīng)的研究方法和研究體系。 在本研究采用的免疫毒性檢測(cè)的方法包括:(1)免疫相關(guān)組織器官的宏觀和微觀病理學(xué)檢查;(2)非放射性CFSE染色法檢測(cè)淋巴細(xì)胞功能(3),巨噬細(xì)胞功能檢查(4)流式細(xì)胞法對(duì)不同亞型淋巴細(xì)胞數(shù)量的測(cè)定(5)ELISA檢測(cè)體液免疫;(6)ELISA法、細(xì)胞內(nèi)染色法、ELISPOT法檢測(cè)T細(xì)胞免疫(細(xì)胞因子的產(chǎn)生)。本研究對(duì)DNA疫苗和病毒載體疫苗建立了實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)其DNA生物分布。一般毒性研究檢測(cè)疫苗對(duì)機(jī)體本身的宏觀毒性反應(yīng),方法包括:血液學(xué)和血清生化學(xué)檢查、大體和組織病理學(xué)檢查、體重、攝食量、臨床癥狀的觀察等。 HSP65-MUC1毒性的研究包括:C57BL/6小鼠單次給藥毒性研究、C57BL/6小鼠反復(fù)給藥毒性研究、恒河猴反復(fù)給藥毒性研究。以臨床研究擬用給藥次數(shù)為“n”,小鼠試驗(yàn)采用“n+1”次給藥,恒河猴采用“n+4”次給藥。研究?jī)?nèi)容包括免疫毒性和一般毒性。DNA疫苗的研究包含在復(fù)合疫苗的毒性研究中,采用BALB/c小鼠反復(fù)給藥研究,完全模擬臨床“3針DNA疫苗prime-1針病毒載體疫苗boost”的給藥方案。研究?jī)?nèi)容包括免疫毒性、一般毒性和生物分布研究。痘苗毒性研究采用BALB/c小鼠,采用“n”次給藥和“n+1”次給藥2種組合,研究?jī)?nèi)容包括免疫毒性、一般毒性和生物分布研究。 本研究中3種疫苗主要的毒性研究結(jié)果為:(1)在小鼠和恒河猴未見(jiàn)與HSP65-MUC1有關(guān)的全身毒性反應(yīng)和免疫毒性反應(yīng);HSP65-MUC1可以誘導(dǎo)較強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。(2)DNA疫苗和痘苗的毒性反應(yīng)包括主要由痘苗引起的注射部位可逆性的局部刺激反應(yīng)、以及部分血液學(xué)指標(biāo)可逆性的變化;復(fù)合疫苗與兩種組分分別單獨(dú)使用相比,可以誘導(dǎo)較強(qiáng)的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。(3)組織分布研究發(fā)現(xiàn)DNA疫苗和痘苗在體內(nèi)不會(huì)廣泛分布、也不會(huì)長(zhǎng)期殘留。 本研究初步建立了關(guān)于疫苗毒理學(xué)研究的主要方法和研究體系,包括(1)建立了疫苗免疫毒性檢測(cè)的方法和體系:免疫相關(guān)組織器官的宏觀和微觀病理學(xué)檢查;建立了非放射性CFSE染色法檢測(cè)淋巴細(xì)胞功能的方法,采用亞型測(cè)定檢測(cè)淋巴細(xì)胞數(shù)量;檢測(cè)體液免疫和細(xì)胞免疫以考察相關(guān)的免疫毒性。(2)建立了免疫原性(體液免疫)和細(xì)胞免疫的監(jiān)測(cè)方法。在不同的時(shí)間點(diǎn)監(jiān)測(cè)毒性指標(biāo),便于捕捉到毒性最敏感的時(shí)期。(3)建立了3種不同的檢測(cè)T細(xì)胞免疫反應(yīng)(γ-IFN水平)的方法:ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清中γ-IFN水平,操作最簡(jiǎn)便,但檢測(cè)靈敏毒最低,在本文腫瘤疫苗的細(xì)胞免疫檢測(cè)種,效果不是很明顯;細(xì)胞內(nèi)染色后流式細(xì)胞法檢測(cè)特定T細(xì)胞產(chǎn)生γ-IFN的能力,該方法操作較簡(jiǎn)單,且比ELISA方法靈敏;ELISPOT法檢測(cè)單細(xì)胞水平產(chǎn)生γ-IFN的能力,該方法操作復(fù)雜,但靈敏度高,可以用來(lái)檢測(cè)T細(xì)胞反應(yīng)不強(qiáng)的疫苗,但因操作過(guò)程復(fù)雜,需要嚴(yán)格控制試驗(yàn)條件,否則會(huì)導(dǎo)致個(gè)體差異大。(4)建立了DNA疫苗和重組病毒載體疫苗的組織分布實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法。這是該類產(chǎn)品必須進(jìn)行的研究項(xiàng)目,既可以得到疫苗的體內(nèi)過(guò)程的信息,也可以初步預(yù)測(cè)DNA疫苗的整合風(fēng)險(xiǎn)。(5)通過(guò)HSP65-MUC1和痘苗的評(píng)價(jià),驗(yàn)證了“n+1”給藥次數(shù)的合理性,并且發(fā)現(xiàn)在腫瘤疫苗中“n+x”,即較多的給藥次數(shù)并未引起免疫耐受,可以為臨床的給藥方案提供參考。在“prime-boost”復(fù)合疫苗的毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì)方面,可以采用新的設(shè)計(jì)思路,如,壓縮研究周期、采用“n”次給藥方案(而不采用“n+1”)以及新的劑量設(shè)計(jì)方法。(6)由于疫苗的作用(體液或細(xì)胞免疫)通常比普通藥物維持時(shí)間長(zhǎng),應(yīng)該根據(jù)其免疫原性的特點(diǎn)設(shè)計(jì)較長(zhǎng)的恢復(fù)期,通常為6～8周(普通藥物一般為2周)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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