【摘要】： STAT3及SoCS3信-N-分子在肝前體細胞增殖分化過程中的作用 前言 肝臟具有較強的再生能力，當肝損傷較輕時，通常由殘存的肝細胞再生以代償肝功能。但當嚴重肝損傷或其他原因影響了正常肝細胞的復制增殖能力時，可以有肝干細胞的活化、增殖和分化。成年哺乳動物肝臟存在著具有分化潛能的細胞，稱為肝前體細胞(Hepatic progenitor cell，HPC)。在一定環(huán)境因素的作用下可以增殖，并分化為肝細胞及膽管細胞。但HPC的活化、增殖及分化機制尚不清楚。信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活子3(Signal transducer and activator of transcription3，STAT3)參與了許多細胞因子及生長因子介導的細胞增殖及分化過程。細胞因子信號抑制子3(Suppressors of cytokine signaling3，SOCS3)是JAK／STAT3信號通路的負反饋調(diào)節(jié)因子。STAT3的活化可以促進SOCS3的產(chǎn)生，而SOCS3則可抑制細胞因子激活的STAT3信號的表達。但其在HPC增殖及分化過程中的作用尚不清楚。本文旨在探討肝衰竭組織中HPC的增殖特點及其與STAT3及SOCS3表達的關(guān)系。并進一步以大鼠肝干細胞樣上皮細胞系WB-F344(簡稱WB細胞)為研究對象，探討STAT3及SOCS3在WB-F344細胞增殖及分化過程中的作用。 方法 (1)本研究采用肝衰竭組織及急、慢性輕型肝炎組織標本共76例，病例選自1965年-2005年中國醫(yī)科大學第一臨床學院尸檢病例、肝臟外科手術(shù)病例及肝活檢病例。所有病例肝組織標本均經(jīng)甲醛固定，石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片進行HE染色以觀察病變特點；應(yīng)用免疫組織化學方法(S-P法)進行OV6、CK19、p-STAT3及SOCS3的檢測。 結(jié)果判定：①OV6免疫組化染色半定量：OV6陽性表達于細胞漿。每張切片隨機選取5個高倍視野，每個視野計數(shù)100個細胞，計算陽性細胞的百分數(shù)�！啊保簾oHPC或有少量HPC；“+”：灶性HPC；“++”：連續(xù)性HPC，但范圍＜50％匯管區(qū)和纖維間隔；“+++”：連續(xù)性HPC，但范圍＞50％匯管區(qū)和纖維間隔。以“—”為陰性，“+”“++”及“+++”為陽性。②CK19、p-STAT3及SOCS3免疫組化染色結(jié)果判定：每張切片隨機選取5個高倍視野，每個視野計數(shù)100個細胞，，計算陽性細胞的百分數(shù)。CK19及SOCS3表達于細胞漿中，p-STAT3表達于細胞核，呈現(xiàn)棕色染色顆粒。無著色或陽性表達率≤25％為陰性，＞25％為陽性。 (2)以大鼠肝干細胞樣上皮細胞系WB-F344細胞為研究對象，肝細胞生長因子(Hepatic growth factor，HGF)及JAK／STAT3通路抑制劑AG490作用于WB-F344細胞后，應(yīng)用免疫熒光及Western blot方法檢測HGF及AG490作用后細胞STAT3、p-STAT3及SOCS3蛋白的表達；應(yīng)用RT-PCR方法檢測HGF及AG490作用后細胞SOCS3 mRNA的表達；應(yīng)用流式細胞術(shù)及MTT法檢測HGF及AG490作用后細胞的細胞周期及凋亡的變化。 (3)應(yīng)用HGF、表皮生長因子(Epithelial growth factor，EGF)、胰島素及地塞米松組成誘導分化體系(高糖DMEM，10％胎牛血清，HGF 10-50ng／ml，EGF 20ng／ml，胰島素1μg／ml及地塞米松1μmol／l)，體外誘導WB-F344細胞向肝細胞定向分化。觀察分化過程中不同時點WB-F344細胞形態(tài)的變化。應(yīng)用RT-PCR方法鑒定WB-F344細胞定向分化過程中分化標志白蛋白(Albumin，ALB)、甲胎蛋白(Alpha-1-fetoprotein，AFP)及細胞角蛋白19(Cytokeratin，CK19)的表達。應(yīng)用Western blot方法檢測WB-F344細胞定向分化過程中STAT3、p-STAT3及SOCS3蛋白的表達；應(yīng)用RT-PCR方法檢測細胞分化過程中SOCS3 mRNA的表達。 (4)統(tǒng)計方法：所有資料采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果 (1)CK19免疫組化染色結(jié)果表明：亞急性肝衰竭((subacute liver failure，SALF)、及慢加急性(亞急性)肝衰竭((acute-on-chronic liver failure，ACLF)組織中可見大量增生的膽管，包括典型增生膽管和非典型增生膽管。肝衰竭組織的CK19陽性率(62.5％)明顯高于急、慢性輕型肝炎組織的陽性率(30％)(P＜0.05)；OV6作為肝前體細胞的標記抗體，其染色陽性的細胞主要有兩種形式。大部分是組成非典型增生膽管的管狀細胞；另一種是匯管區(qū)出現(xiàn)的小肝細胞樣細胞。肝衰竭組織的OV6陽性率(85.7％)明顯高于急、慢性輕型肝炎組織的陽性率(35.0％)(P＜0.05)；p-STAT3的陽性表達主要位于匯管區(qū)增生的膽管細胞、HPC、炎性細胞、竇內(nèi)皮細胞及肝細胞的細胞核中。肝衰竭組織的p-STAT3陽性率(67.9％)明顯高于急、慢性輕型肝炎的組織的陽性率(25％)(P＜0.05)；SOCS3的陽性表達主要位于匯管區(qū)的增生的膽管細胞、炎性細胞及肝細胞的細胞漿中。肝衰竭組織的SOCS3陽性率(60.7％)明顯高于急、慢性輕型肝炎組織的陽性率(35％)(P＜0.05)。相關(guān)分析表明，OV6的表達與CK19、p-STAT3及SOCS3的表達呈正相關(guān)(r_s分別為0.689，0.239及0.322，P＜0.05)。 (2)STAT3水平在HGF作用于WB-F344細胞前后無明顯變化(P＞0.05)；HGF能夠促進STAT3的磷酸化，p-STAT3在HGF作用10分鐘后增加，完全磷酸化發(fā)生在HGF作用30分鐘，60分鐘后表達逐漸減弱。應(yīng)用AG490后p-STAT3表達減弱(P＜0.05)；正常WB-F344細胞有SOCS3蛋白及mRNA表達，在HGF作用10分鐘后SOCS3表達增加，以后逐漸減弱。應(yīng)用AG490后SOCS3表達減弱(P＜0.05)。HGF作用于WB-F344細胞后細胞周期S期細胞數(shù)增加，G1期細胞數(shù)減少，凋亡細胞減少，這種作用呈劑量效應(yīng)關(guān)系(P＜0.05)。應(yīng)用AG490后能夠抑制WB-F344細胞的增殖，促進細胞凋亡。 (3)WB-F344細胞在加入分化培養(yǎng)體系2天后細胞出現(xiàn)離散效應(yīng)。實驗7天后細胞延伸并形成小梁樣結(jié)構(gòu)，細胞逐漸由六邊形轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮巍?1天后分化為肝細胞樣梭形形態(tài)，細胞生長緩慢，形態(tài)逐漸出現(xiàn)分散。RT-PCR方法檢測表明細胞分化過程中表達肝細胞標志ALB的水平逐漸增加，作為肝干細胞標志之一的AFP的表達逐漸減少，CK19這一膽管細胞的表達標志逐漸減少(P＜0.05／)。上述結(jié)果提示HGF、EGF、胰島素及地塞米松可以誘導WB-F344體外向肝細胞定向分化。應(yīng)用Western blot方法檢測表明STAT3蛋白在分化過程中無明顯變化(P＞0.05)；p-STAT3蛋白表達在分化過程中逐漸減少(P＜0.05)；應(yīng)用RT-PCR及Western blot方法檢測表明SOCS3 mRNA及蛋白表達在分化過程中逐漸減少(P＜0.05)。 結(jié)論 (1)肝衰竭組織中存在HPC的增殖；肝衰竭組織中p-STAT3及SOCS3的表達增加，與HPC表達成正相關(guān)。提示p-STAT3及SOCS3參與肝衰竭組織中HPC增殖的調(diào)控。 (2)HGF能夠促進WB-F344細胞STAT3的磷酸化水平，增加SOCS3表達；HGF能夠促進WB細胞的增殖并抑制細胞凋亡，STAT3及SOCS3參與了這一過程的調(diào)控。 (3)HGF、EGF、胰島素及地塞米松組成的分化培養(yǎng)體系能夠體外誘導WB-F344細胞向肝細胞定向分化；分化過程中p-STAT3及SOCS3的表達逐漸減少，提示其可能對于抑制WB-F344細胞的分化，使其維持未分化狀態(tài)具有重要的作用。
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【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R363

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 Shree Ram SINGH,Steven X. HOU;JAK/STAT signaling regulates tissue outgrowth and male germline stem cell fate in Drosophila[J];Cell Research;2005年01期

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3 Atsushi Masamune;Masahiro Satoh;Kazuhiro Kikuta;Noriaki Suzuki;Tooru Shimosegawa;;Activation of JAK-STAT pathway is required for platelet-derived growth factor-induced proliferation of pancreatic stellate cells[J];World Journal of Gastroenterology;2005年22期

本文編號：2396510