【摘要】： STAT3及SoCS3信-N-分子在肝前體細(xì)胞增殖分化過程中的作用 前言 肝臟具有較強(qiáng)的再生能力，當(dāng)肝損傷較輕時(shí)，通常由殘存的肝細(xì)胞再生以代償肝功能。但當(dāng)嚴(yán)重肝損傷或其他原因影響了正常肝細(xì)胞的復(fù)制增殖能力時(shí)，可以有肝干細(xì)胞的活化、增殖和分化。成年哺乳動(dòng)物肝臟存在著具有分化潛能的細(xì)胞，稱為肝前體細(xì)胞(Hepatic progenitor cell，HPC)。在一定環(huán)境因素的作用下可以增殖，并分化為肝細(xì)胞及膽管細(xì)胞。但HPC的活化、增殖及分化機(jī)制尚不清楚。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(Signal transducer and activator of transcription3，STAT3)參與了許多細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的細(xì)胞增殖及分化過程。細(xì)胞因子信號(hào)抑制子3(Suppressors of cytokine signaling3，SOCS3)是JAK／STAT3信號(hào)通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子。STAT3的活化可以促進(jìn)SOCS3的產(chǎn)生，而SOCS3則可抑制細(xì)胞因子激活的STAT3信號(hào)的表達(dá)。但其在HPC增殖及分化過程中的作用尚不清楚。本文旨在探討肝衰竭組織中HPC的增殖特點(diǎn)及其與STAT3及SOCS3表達(dá)的關(guān)系。并進(jìn)一步以大鼠肝干細(xì)胞樣上皮細(xì)胞系WB-F344(簡(jiǎn)稱WB細(xì)胞)為研究對(duì)象，探討STAT3及SOCS3在WB-F344細(xì)胞增殖及分化過程中的作用。 方法 (1)本研究采用肝衰竭組織及急、慢性輕型肝炎組織標(biāo)本共76例，病例選自1965年-2005年中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院尸檢病例、肝臟外科手術(shù)病例及肝活檢病例。所有病例肝組織標(biāo)本均經(jīng)甲醛固定，石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片進(jìn)行HE染色以觀察病變特點(diǎn)；應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法(S-P法)進(jìn)行OV6、CK19、p-STAT3及SOCS3的檢測(cè)。 結(jié)果判定：①OV6免疫組化染色半定量：OV6陽(yáng)性表達(dá)于細(xì)胞漿。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)�！啊保簾oHPC或有少量HPC；“+”：灶性HPC；“++”：連續(xù)性HPC，但范圍＜50％匯管區(qū)和纖維間隔；“+++”：連續(xù)性HPC，但范圍＞50％匯管區(qū)和纖維間隔。以“—”為陰性，“+”“++”及“+++”為陽(yáng)性。②CK19、p-STAT3及SOCS3免疫組化染色結(jié)果判定：每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。CK19及SOCS3表達(dá)于細(xì)胞漿中，p-STAT3表達(dá)于細(xì)胞核，呈現(xiàn)棕色染色顆粒。無著色或陽(yáng)性表達(dá)率≤25％為陰性，＞25％為陽(yáng)性。 (2)以大鼠肝干細(xì)胞樣上皮細(xì)胞系WB-F344細(xì)胞為研究對(duì)象，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Hepatic growth factor，HGF)及JAK／STAT3通路抑制劑AG490作用于WB-F344細(xì)胞后，應(yīng)用免疫熒光及Western blot方法檢測(cè)HGF及AG490作用后細(xì)胞STAT3、p-STAT3及SOCS3蛋白的表達(dá)；應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)HGF及AG490作用后細(xì)胞SOCS3 mRNA的表達(dá)；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)及MTT法檢測(cè)HGF及AG490作用后細(xì)胞的細(xì)胞周期及凋亡的變化。 (3)應(yīng)用HGF、表皮生長(zhǎng)因子(Epithelial growth factor，EGF)、胰島素及地塞米松組成誘導(dǎo)分化體系(高糖DMEM，10％胎牛血清，HGF 10-50ng／ml，EGF 20ng／ml，胰島素1μg／ml及地塞米松1μmol／l)，體外誘導(dǎo)WB-F344細(xì)胞向肝細(xì)胞定向分化。觀察分化過程中不同時(shí)點(diǎn)WB-F344細(xì)胞形態(tài)的變化。應(yīng)用RT-PCR方法鑒定WB-F344細(xì)胞定向分化過程中分化標(biāo)志白蛋白(Albumin，ALB)、甲胎蛋白(Alpha-1-fetoprotein，AFP)及細(xì)胞角蛋白19(Cytokeratin，CK19)的表達(dá)。應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)WB-F344細(xì)胞定向分化過程中STAT3、p-STAT3及SOCS3蛋白的表達(dá)；應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞分化過程中SOCS3 mRNA的表達(dá)。 (4)統(tǒng)計(jì)方法：所有資料采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 (1)CK19免疫組化染色結(jié)果表明：亞急性肝衰竭((subacute liver failure，SALF)、及慢加急性(亞急性)肝衰竭((acute-on-chronic liver failure，ACLF)組織中可見大量增生的膽管，包括典型增生膽管和非典型增生膽管。肝衰竭組織的CK19陽(yáng)性率(62.5％)明顯高于急、慢性輕型肝炎組織的陽(yáng)性率(30％)(P＜0.05)；OV6作為肝前體細(xì)胞的標(biāo)記抗體，其染色陽(yáng)性的細(xì)胞主要有兩種形式。大部分是組成非典型增生膽管的管狀細(xì)胞；另一種是匯管區(qū)出現(xiàn)的小肝細(xì)胞樣細(xì)胞。肝衰竭組織的OV6陽(yáng)性率(85.7％)明顯高于急、慢性輕型肝炎組織的陽(yáng)性率(35.0％)(P＜0.05)；p-STAT3的陽(yáng)性表達(dá)主要位于匯管區(qū)增生的膽管細(xì)胞、HPC、炎性細(xì)胞、竇內(nèi)皮細(xì)胞及肝細(xì)胞的細(xì)胞核中。肝衰竭組織的p-STAT3陽(yáng)性率(67.9％)明顯高于急、慢性輕型肝炎的組織的陽(yáng)性率(25％)(P＜0.05)；SOCS3的陽(yáng)性表達(dá)主要位于匯管區(qū)的增生的膽管細(xì)胞、炎性細(xì)胞及肝細(xì)胞的細(xì)胞漿中。肝衰竭組織的SOCS3陽(yáng)性率(60.7％)明顯高于急、慢性輕型肝炎組織的陽(yáng)性率(35％)(P＜0.05)。相關(guān)分析表明，OV6的表達(dá)與CK19、p-STAT3及SOCS3的表達(dá)呈正相關(guān)(r_s分別為0.689，0.239及0.322，P＜0.05)。 (2)STAT3水平在HGF作用于WB-F344細(xì)胞前后無明顯變化(P＞0.05)；HGF能夠促進(jìn)STAT3的磷酸化，p-STAT3在HGF作用10分鐘后增加，完全磷酸化發(fā)生在HGF作用30分鐘，60分鐘后表達(dá)逐漸減弱。應(yīng)用AG490后p-STAT3表達(dá)減弱(P＜0.05)；正常WB-F344細(xì)胞有SOCS3蛋白及mRNA表達(dá)，在HGF作用10分鐘后SOCS3表達(dá)增加，以后逐漸減弱。應(yīng)用AG490后SOCS3表達(dá)減弱(P＜0.05)。HGF作用于WB-F344細(xì)胞后細(xì)胞周期S期細(xì)胞數(shù)增加，G1期細(xì)胞數(shù)減少，凋亡細(xì)胞減少，這種作用呈劑量效應(yīng)關(guān)系(P＜0.05)。應(yīng)用AG490后能夠抑制WB-F344細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。 (3)WB-F344細(xì)胞在加入分化培養(yǎng)體系2天后細(xì)胞出現(xiàn)離散效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)7天后細(xì)胞延伸并形成小梁樣結(jié)構(gòu)，細(xì)胞逐漸由六邊形轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮巍?1天后分化為肝細(xì)胞樣梭形形態(tài)，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，形態(tài)逐漸出現(xiàn)分散。RT-PCR方法檢測(cè)表明細(xì)胞分化過程中表達(dá)肝細(xì)胞標(biāo)志ALB的水平逐漸增加，作為肝干細(xì)胞標(biāo)志之一的AFP的表達(dá)逐漸減少，CK19這一膽管細(xì)胞的表達(dá)標(biāo)志逐漸減少(P＜0.05／)。上述結(jié)果提示HGF、EGF、胰島素及地塞米松可以誘導(dǎo)WB-F344體外向肝細(xì)胞定向分化。應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)表明STAT3蛋白在分化過程中無明顯變化(P＞0.05)；p-STAT3蛋白表達(dá)在分化過程中逐漸減少(P＜0.05)；應(yīng)用RT-PCR及Western blot方法檢測(cè)表明SOCS3 mRNA及蛋白表達(dá)在分化過程中逐漸減少(P＜0.05)。 結(jié)論 (1)肝衰竭組織中存在HPC的增殖；肝衰竭組織中p-STAT3及SOCS3的表達(dá)增加，與HPC表達(dá)成正相關(guān)。提示p-STAT3及SOCS3參與肝衰竭組織中HPC增殖的調(diào)控。 (2)HGF能夠促進(jìn)WB-F344細(xì)胞STAT3的磷酸化水平，增加SOCS3表達(dá)；HGF能夠促進(jìn)WB細(xì)胞的增殖并抑制細(xì)胞凋亡，STAT3及SOCS3參與了這一過程的調(diào)控。 (3)HGF、EGF、胰島素及地塞米松組成的分化培養(yǎng)體系能夠體外誘導(dǎo)WB-F344細(xì)胞向肝細(xì)胞定向分化；分化過程中p-STAT3及SOCS3的表達(dá)逐漸減少，提示其可能對(duì)于抑制WB-F344細(xì)胞的分化，使其維持未分化狀態(tài)具有重要的作用。
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【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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2 王宇明,陳耀凱;肝干細(xì)胞研究方法進(jìn)展[J];中華實(shí)驗(yàn)外科雜志;2002年02期

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本文編號(hào)：2396510