發(fā)布時(shí)間：2018-12-25 19:06

【摘要】：目的 細(xì)菌內(nèi)同源重組制備含hNGFβ基因的重組腺病毒質(zhì)粒,在293細(xì)胞內(nèi) 包裝擴(kuò)增后純化重組腺病毒。 方法 將hNGFβ外源性核酸片段插入到經(jīng)Xma Ⅰ與Xba Ⅰ酶切的pBluescript Ⅱ sk(+),構(gòu)建成轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBluescript Ⅱ sk(+)—hNGFβ,將其與穿梭質(zhì)粒 pShuttle-CMV各自經(jīng)Kpn Ⅰ和Not Ⅰ雙酶切,酶切產(chǎn)物定向重組,構(gòu)建穿梭質(zhì)粒 pShuttle-CMV-hNGFβ。將該穿梭質(zhì)粒經(jīng)Pme Ⅰ酶切后,轉(zhuǎn)化含腺病毒骨架質(zhì)粒 pAdEasy-1的感受態(tài)細(xì)菌BJ5183,重組為pAdEasy-1-hNGFβ,經(jīng)酶切鑒定正確后, 用Lipofect介導(dǎo)pAdEasy-1-hNGFβ轉(zhuǎn)染Ad293細(xì)胞,包裝成重組腺病毒Ad-hNGF β,用PCR進(jìn)行鑒定。透析純化后的腺病毒采用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行滴度測(cè)定, 測(cè)得滴度為2.24×10~(12)PFU/L。 結(jié)果 (1) 線性化的pShuttle-CMV-hNGFβ轉(zhuǎn)化含pAdEasy-1的感受態(tài)細(xì)菌 BJ5183,24h后獲得了30%陽(yáng)性重組質(zhì)粒,經(jīng)酶切得到一條大于20kb的大片段和 一條4.5kb的特征性條帶。(2)重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Ad293細(xì)胞,第15d細(xì)胞出 現(xiàn)病變,擴(kuò)增后,經(jīng)CsCl密度梯度離心獲得2.24×10~(12)PFU/L的高滴度腺病毒, 經(jīng)PCR鑒定正確。 結(jié)論 應(yīng)用細(xì)菌內(nèi)同源重組能快速構(gòu)建含hNGFβ基因的重組腺病毒載體 Ad-hNGFβ,酶切鑒定,包裝為高滴度的重組腺病毒Ad—hNGFβ,為hNGFβ基 因的應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective to prepare recombinant adenovirus plasmid containing hNGF 尾 gene by homologous recombination in bacteria and purify recombinant adenovirus after packaging and amplification in 293 cells. Methods hNGF 尾 exogenous nucleic acid fragment was inserted into pBluescript 鈪，

本文編號(hào)：2391515