發(fā)布時(shí)間：2018-12-23 19:20

【摘要】： 產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是人獸共患李斯特菌病的病原,主要通過(guò)食用被LM污染的食品感染,能引發(fā)人的腦膜炎、發(fā)熱性敗血性胃腸炎、孕婦流產(chǎn)等,感染后發(fā)病死亡率約為25%。歐美國(guó)家曾多次暴發(fā)流行,LM對(duì)食品的污染與危害,已引起世界各國(guó)的普遍關(guān)注和高度重視,其中研制預(yù)防李斯特菌病的減毒活疫苗是重要的課題之一。另一方面,鑒于LM是胞內(nèi)寄生菌,減毒LM是非常有前景的疫苗載體之一。為此,本研究通過(guò)同源重組的方式對(duì)血清型為1/2a的野生型菌株基因組中相鄰的兩毒力基因actA和plcB進(jìn)行缺失,獲得減毒重組菌株,并以減毒株開(kāi)展了以原核和真核表達(dá)的不同方式運(yùn)送模式蛋白GFP的研究。為了對(duì)減毒株的免疫保護(hù)力進(jìn)行評(píng)價(jià),以及從不同水平上證實(shí)基因的缺失,對(duì)毒力基因hly和actA在大腸桿菌中進(jìn)行了原核表達(dá)并對(duì)ActA蛋白進(jìn)行了單抗的研制。 減毒突變株的獲得不僅對(duì)李斯特菌病的預(yù)防具有重要作用,而且為構(gòu)建預(yù)防人類和動(dòng)物疫病的疫苗載體奠定了基礎(chǔ)。此外,對(duì)于LM闡明毒力因子的致病機(jī)理與免疫保護(hù)作用提供了條件。 1.產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌actA基因和hly基因的原核表達(dá)及ActA單克隆抗體的研制 利用PCR技術(shù)從血清型1/2a的LM4株中擴(kuò)增出actA基因,經(jīng)克隆篩選和測(cè)序鑒定后,構(gòu)建成該基因的原核表達(dá)載體pGEX-6P-1-actA及pET-actA,轉(zhuǎn)入終宿主菌E.coli后,IPTG誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明,actA基因在兩種載體中均獲得表達(dá),融合蛋白的大小分別約為120KD和97KD。
[Abstract]:Listeria monocytogenes (Listeria monocytogenes,LM) is the pathogen of Listeria monocytogenes. It can cause meningitis, febrile septic gastroenteritis, miscarriage of pregnant women and so on by eating food contaminated with LM. The death rate after infection was about 25%. There have been many outbreaks in Europe and America, and the contamination and harm of food by LM has attracted worldwide attention. Among them, the development of live attenuated vaccine against Listeria monocytogenes is one of the most important topics. On the other hand, since LM is an intracellular parasite, attenuated LM is one of the promising vaccine vectors. In this study, two virulence genes, actA and plcB, were deleted from the genome of wild-type strains with serotype of 1 / 2a by homologous recombination, and the attenuated recombinant strains were obtained. The study on the transport of mode protein GFP by prokaryotic and eukaryotic expression was carried out with attenuated strain. In order to evaluate the immune protection of the attenuated strain and to confirm the deletion of the gene at different levels, the virulence genes hly and actA were expressed in E. coli and the monoclonal antibody against ActA protein was developed. The acquisition of attenuated mutants not only plays an important role in the prevention of Listeria, but also lays a foundation for the construction of vaccine vectors for the prevention of human and animal diseases. In addition, it provides conditions for LM to elucidate the pathogenicity of virulence factors and immune protection. 1. Prokaryotic expression of actA gene and hly gene of Listeria monocytogenes and preparation of ActA monoclonal antibody actA gene was amplified from 1 / 2 a LM4 strain of serotype by PCR technique. The expression of the target protein was induced by IPTG after the construction of prokaryotic expression vectors pGEX-6P-1-actA and pET-actA, into E.coli. The results of SDS-PAGE electrophoresis showed that actA gene was expressed in both vectors. The size of the fusion protein was about 120KD and 97kD, respectively.
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R378

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本文編號(hào)：2390150