發(fā)布時間：2018-12-07 14:46

【摘要】： 陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)是一種常見的性傳播疾病，人群普遍易感。據(jù)報道全世界每年約有170萬感染病例。陰道毛滴蟲是一種具有鞭毛的寄生性原蟲，人體感染后可引起一系列的臨床癥狀。約50％的婦女感染陰道毛滴蟲后無任何癥狀，其中1／3的婦女6個月內(nèi)可發(fā)展成為有癥狀的感染者。急性感染可出現(xiàn)宮頸陰道黏膜上皮出血、脫落等急性陰道炎癥狀。慢性感染可引起性交時癢痛。此外研究表明滴蟲病與宮頸癌、非典型盆腔炎癥、婦女不育癥有關。孕婦感染陰道毛滴蟲后可導致胎膜早破、早產(chǎn)，低體重兒。男性感染陰道毛滴蟲后大多無癥狀，部分可引起尿道炎，前列腺炎。另外陰道毛滴蟲也是增加人類免疫缺陷病毒(HIV)感染的因素。陰道毛滴蟲最常見的病原學診斷方法是在顯微鏡下直接觀察。該診斷方法盡管操作簡便且所需費用較低，但敏感度較差，與培養(yǎng)法相比較敏感度僅達到其35％-80％，同時要求檢驗人員有較豐富的臨床診斷經(jīng)驗。目前被公認的診斷陰道毛滴蟲感染“金標準”是培養(yǎng)法，常用的培養(yǎng)基包括Diamond's，Trichosel和InPouch TV培養(yǎng)基。但尚無任何一種培養(yǎng)基，單一診斷陰道毛滴蟲感染時敏感度達到100％，且該方法費時費力，診斷費用較昂貴。國內(nèi)外學者對陰道毛滴蟲感染的免疫學診斷進行了大量研究，由于抗原成份復雜，對該蟲感染者進行免疫學診斷時，其抗原常與其他寄生蟲病患者的血清交叉反應而出現(xiàn)假陽性，特異性較差。為了尋找診斷該病的特異性抗原，本研究應用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對陰道毛滴蟲可溶性抗原進行分析，然后與經(jīng)該蟲免疫小鼠血清進行免疫印跡(Western blot)，為建立敏感、特異的滴蟲感染免疫學診斷方法奠定基礎。 材料與方法 1．陰道毛滴蟲蟲體培養(yǎng)陰道毛滴蟲蟲株取自婦女陰道分泌物，接種到肝浸湯進行培養(yǎng)。蟲體培養(yǎng)生長24h后，室溫下離心(500×g)蟲體，后用PBS緩沖液(pH7.2)洗滌。 2．陰道毛滴蟲蟲體可溶性抗原制備蟲體分別反復凍融、超聲粉碎、離心，取上清作為蟲體可溶性抗原，，并測定抗原的濃度。 3．陰道毛滴蟲蟲體多克隆抗體制備BALB／c小鼠每5只隨機分為一組進行免疫，以在-80℃冷凍保存?zhèn)溆玫年幍烂蜗x蟲體作為抗原，采用背部皮下多點注射進行免疫。首次免疫采用福氏(Freund adjuvant)完全免疫佐劑，加強免疫采用福氏不完全免疫佐劑，佐劑與抗原的體積之比為1：1。每2周免疫一次，在第2次加強免疫2周后通過眼球取小鼠血，獲取鼠抗陰道毛滴蟲蟲體血清。 4．抗體效價檢測ELISA檢測鼠抗陰道毛滴蟲蟲體血清抗體滴度。 5．樣品制備可溶性抗原與樣品緩沖液1：4混合，在100℃熱水中加熱3-5分鐘。 6，SDS-PAGE用Bio-Rad電泳系統(tǒng)對上述抗原進行SDS-PAGE分析，采用10％的分離膠和5％的濃縮膠。充分染色、褪色后可看到各自不同的電泳帶。根據(jù)標準蛋白分子量蛋白帶的遷移率及其分子量的對數(shù)繪制標準曲線，測量各條蛋白帶的遷移率，查出與其對應的分子量。 7．Western blot抗原轉移至硝酸纖維素膜上采用Western blot對陰道毛滴蟲蟲體可溶性抗原進行免疫分析。 結果 1．鼠抗陰道毛滴蟲蟲體免疫血清抗體滴度檢測陰道毛滴蟲蟲體3次免疫小鼠半月后，取血清經(jīng)ELISA檢測血清抗體滴度達1：100000。 2．電泳樣本蛋白含量的選擇加樣孔內(nèi)蛋白含量的不同，電泳帶清晰度有所差異。樣品濃度越高，加樣量越少，電泳效果越好，用Bio-Rad公司的Mini電泳系統(tǒng)時，加樣量在18μg／孔，電泳效果最好。 3．陰道毛滴蟲蟲體可溶性抗原電泳分析陰道毛滴蟲全蟲可溶性抗原經(jīng)SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色顯示32條蛋白帶。在32條全蟲抗原蛋白帶中，分子量在100kDa以上有9條，其余在15～97kDa之間，主帶有8條，分別是110、97、75、60、57、34、26、和15kDa。 5．陰道毛滴蟲蟲體可溶性抗原免疫印記分析在SDS-PAGE凝膠中的陰道毛滴蟲可溶性抗原32條蛋白帶中顯示廣泛的免疫反應，除86、75和22kDa處均未顯示棕色條帶，無免疫原性，其余各條蛋白帶均有反應。且以110、97、60和26kDa免疫反應性最強，顯色最深為主要反應帶。值得注意的是，SDS-PAGE凝膠考馬斯亮藍染色不清楚的蛋白帶經(jīng)酶聯(lián)免疫染色后變?yōu)榍逦梢�，如大�?00kDa的3條蛋白帶，90、72、46及18kDa�？梢娪行┑蜗x抗原量雖少，卻可產(chǎn)生明顯的免疫反應。 結論 1．陰道毛滴蟲蟲體可溶性抗原電泳分析陰道毛滴蟲全蟲可溶性抗原有32條蛋白帶，主帶為110、97、75、60、57、34、26、和15kDa。 2．陰道毛滴蟲蟲體可溶性抗原免疫印記分析陰道毛滴蟲可溶性抗原中的110、97、60、26kDa分子量的蛋白組分對特異性診斷陰道毛滴蟲具有重要價值。
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【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：2367361