【摘要】： I基因治療成功的關(guān)鍵是需要高效、安全和靶向的載體系統(tǒng),將DNA轉(zhuǎn)移至靶細胞核內(nèi)進行表達。聚酰胺-胺型樹狀大分子(PAMAM)是一類納米級的聚合物分子,具有高度支化的球形結(jié)構(gòu),分子內(nèi)含有大量的伯胺和叔胺基團,能與DNA自組裝形成帶正電荷的緊湊復合物,將DNA輸送至多種類型的細胞中。在本論文中,我們對DNA和PAMAM的相互作用及其動力學過程進行了系統(tǒng)的表征,并研究聚丙交酯乙交酯(PLGA)、聚乳酸(PLA)和陽離子脂質(zhì)體與PAMAM和DNA復合物的組裝行為及其對轉(zhuǎn)染效率的影響。完成的工作包括以下幾個方面: (1)通過瓊脂糖凝膠電泳、[Ru(phen)2dppz]2+置換和排除實驗、粒徑和電位測試考察PAMAM與DNA的相互作用,圓二色譜(CD)和傅立葉紅外光譜(FTIR)研究二者組裝過程中DNA構(gòu)象的變化。結(jié)果表明,PAMAM與DNA在N/P比大于1.5時形成了穩(wěn)定且?guī)д姾傻膹秃衔?平均粒徑在150-180 nm范圍內(nèi)。與裸質(zhì)粒相比,DNA與PAMAM復合后270 nm處CD信號強度減弱,峰位置發(fā)生紅移;增加溶液離子強度、過低或過高的pH值都會引起CD信號的降低,說明DNA螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。FTIR光譜研究表明復合狀態(tài)的質(zhì)粒DNA仍保留其典型的B型構(gòu)象,只是其堿基堆積作用受到了強烈的擾動。 (2)應(yīng)用熒光停流技術(shù)研究DNA與PAMAM相互作用的動力學,包括兩者的復合過程及其逆過程(即DNA從復合物中的解離)。結(jié)果表明DNA的壓縮是復合過程的速率決定步驟,而DNA的伸展和去折疊是解離過程的速率決定步驟。在較低的N/P比時,形成的PAMAM/DNA復合物是松散的,可在一定程度內(nèi)發(fā)生解離。而在N/P比達到2.0以上后,DNA在PAMAM的作用下被完全壓縮,復合物處于熱力學最穩(wěn)定的狀態(tài),解離變得越來越困難。 (3)采用乳化-分散-蒸發(fā)方法制備了含PAMAM的PLGA納米粒,并與DNA復合。通過瓊脂糖凝膠電泳、熒光置換、粒徑和電位測試表征復合物的形成,核酸酶酶切實驗考察復合物對DNA的保護作用,噻唑藍(MTT)方法研究復合物的細胞毒性,同時應(yīng)用體外轉(zhuǎn)染實驗研究復合物的轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果表明DNA與陽離子納米粒在N/P比2以上形成了穩(wěn)定、緊湊的復合物。復合物的zeta電位在低N/P比時為負值,隨N/P比的增加而增加,并在N/P比2以上時變?yōu)檎�。酶切實驗表明復合物能保護DNA抵御酶的降解作用。復合物的細胞毒性較小,對HepG2和NIH-3T3細胞的生長狀態(tài)沒有太大的影響。在無血清介質(zhì)中,DNA與陽離子納米粒形成的復合物可以被有效地轉(zhuǎn)移到這兩種細胞內(nèi)得到表達,其轉(zhuǎn)染效率比PAMAM/DNA復合物明顯升高。而且,轉(zhuǎn)染的最佳N/P比為0.9-1.5,復合物還沒有達到完全壓縮的狀態(tài),可能有利于DNA從復合物中解離出來并進入細胞核。 (4)采用乳化-分散-蒸發(fā)方法制備了含PAMAM的PLA納米粒,并與DNA復合,考察復合物的理化性質(zhì)、細胞毒性和轉(zhuǎn)染效率。瓊脂糖凝膠電泳、熒光置換、粒徑和電位測試的結(jié)果表明在N/P比2以上時,DNA與陽離子納米粒形成了穩(wěn)定且?guī)д姷膹秃衔铩：怂崦该盖袑嶒灥慕Y(jié)果表明復合物能保護DNA抵御核酸酶的降解。MTT實驗的結(jié)果說明復合物的細胞毒性較小。在無血清介質(zhì)中,陽離子納米粒可以將DNA有效地轉(zhuǎn)移到兩種細胞內(nèi)得到表達,轉(zhuǎn)染效率與單純的PAMAM相比有明顯的提高,且轉(zhuǎn)染的最佳N/P比為2-5。 (5)薄膜超聲法制備DOTAP/DOPE陽離子脂質(zhì)體,并與PAMAM和DNA形成三元復合物,考察其理化性質(zhì)、細胞毒性和轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果表明在PAMAM與DNA比例r=0.5以上時(實驗中陽離子脂質(zhì)體/DNA的比例r’固定為3.0),形成了穩(wěn)定的復合物,能保護DNA免受核酸酶的降解,但是對細胞生長有一定程度的抑制。在有血清介質(zhì)中,與單純的陽離子脂質(zhì)體或PAMAM相比,該三元復合物在一定的r值范圍內(nèi)(從1.2到2)對HepG2細胞具有較高的轉(zhuǎn)染效率。 綜上所述,PAMAM與DNA通過靜電相互作用自組裝形成復合物,在一定程度內(nèi)可發(fā)生解離;但是當N/P比大于2.0時,兩者的結(jié)合呈現(xiàn)出不可逆的趨勢。此外,PLGA、PLA納米粒和陽離子脂質(zhì)體對PAMAM介導的轉(zhuǎn)染效率有一定的促進作用。
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【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2006
【分類號】：R346

【參考文獻】

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