【摘要】： 目的構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-6p-2/Foxp3,并轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌E.coli BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá),以純化蛋白為抗原免疫新西蘭兔制備抗小鼠Foxp3的多克隆抗體,對(duì)抗體進(jìn)行滴度及特異性的分析。以制備的抗體為一抗Western-blot檢測(cè)小鼠1型糖尿病模型脾細(xì)胞中Foxp3的表達(dá)情況,為進(jìn)一步研究Foxp3奠定了基礎(chǔ)。 方法(1)小鼠Foxp3重組蛋白的表達(dá)、純化和多抗制備軟件分析小鼠Foxp3基因,選取第532～1008bp位堿基序列為目的基因,其編碼產(chǎn)物159aa具有強(qiáng)抗原性及高特異性。以pMIGR1/ Foxp3重組質(zhì)粒為模板,PCR擴(kuò)增目的片斷,將目的片斷克隆至原核表達(dá)載體pGEX-6p-2,構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-6p-2/Foxp3,經(jīng)酶切、PCR及測(cè)序鑒定后轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌E.coli BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE和Western-Blot鑒定表達(dá)產(chǎn)物;對(duì)重組融合蛋白(目的蛋白和GST蛋白)進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá),用GST瓊脂糖凝膠FF純化柱純化,SDS-PAGE和Western-Blot分析和鑒定純化蛋白,采用BCA試劑盒測(cè)定純化蛋白濃度;用純化的重組融合蛋白免疫新西蘭兔,制備抗血清;采用ELISA法測(cè)定抗血清效價(jià);利用脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染pMIGR1/Foxp3及pMIGR1入NIH3T3細(xì)胞,提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總蛋白,以制備的多抗為一抗進(jìn)行Western-blot法檢測(cè)NIH3T3轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)的Foxp3,對(duì)制備的多抗進(jìn)行特異性分析。(2) Foxp3在小鼠1型糖尿病模型中的表達(dá)研究用STZ誘導(dǎo)小鼠1型糖尿病模型,嚴(yán)密觀(guān)察飲食情況,定期稱(chēng)體重,測(cè)量尿糖及血糖變化,制作胰腺、胃黏膜及甲狀腺組織的病理切片以觀(guān)察其病理改變;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞和CD4+CD25+T細(xì)胞數(shù)量的變化;RT-PCR、半定量Western-blot分別在mRNA、蛋白水平檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞中Foxp3的表達(dá)。 結(jié)果PCR擴(kuò)增得到長(zhǎng)477bp的目的片斷;構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGEX-6p-2/Foxp3經(jīng)酶切、PCR和測(cè)序鑒定證明其中插入片段為目的基因;含pGEX-6p-2/Foxp3重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo),SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示,得到一分子量約45kDa的重組融合蛋白GST-Foxp3,用GST瓊脂糖凝膠FF純化柱對(duì)重組融合蛋白進(jìn)行純化;Western-blot鑒定誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白及純化蛋白能被抗GST單抗識(shí)別,在45kDa附近有特異條帶,與預(yù)期融合蛋白大小一致;以純化的Foxp3重組融合蛋白為抗原免疫新西蘭兔制備抗Foxp3抗體,ELISA法檢測(cè)所得抗體效價(jià)在1∶1 2 800以上,Western-blot結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染pMIGR1/Foxp3的NIH3T3細(xì)胞總蛋白能被抗小鼠Foxp3多抗特異性識(shí)別,而轉(zhuǎn)染pMIGR1的NIH3T3細(xì)胞總蛋白未出現(xiàn)任何條帶;STZ誘導(dǎo)的小鼠1型糖尿病模型組與正常組及對(duì)照組相比,有明顯的多飲、多食、多尿和體重減輕等典型的糖尿病表現(xiàn);模型鼠在造模1月后出現(xiàn)不同程度的尿糖改變,血糖水平也顯著升高,胰島有不同程度的胰島炎性改變,而其它兩組尿糖均陰性,血糖水平正常,胰島未發(fā)生病理改變;流式分析T淋巴細(xì)胞亞群在小鼠脾細(xì)胞中的比例在各組之間變化明顯,用STZ致誘小鼠糖尿病后,CD4+T細(xì)胞顯著升高,而CD4+CD25+T細(xì)胞在模型組小鼠脾細(xì)胞中的比例也較正常組及對(duì)照組稍有升高,但是模型組CD4+CD25+T與CD4+T細(xì)胞的比值較正常組及對(duì)照組顯著偏低;RT-PCR檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞中Foxp3 mRNA的表達(dá)水平,模型組小鼠的脾細(xì)胞中Foxp3 mRNA的表達(dá)與內(nèi)參(G3PDH)的比稍高于正常組及對(duì)照組;半定量Western-blot結(jié)果顯示模型組的脾細(xì)胞中Foxp3在蛋白水平的表達(dá)量亦稍高于正常組及對(duì)照組。 結(jié)論 (1)成功構(gòu)建了pGEX-6p-2/Foxp3原核表達(dá)載體,其在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)出一分子量約為45kDa的重組融合蛋白; (2)誘導(dǎo)表達(dá)的重組融合蛋白具有較好的免疫原性,能刺激新西蘭兔產(chǎn)生高效價(jià)的特異性抗體; (3)小鼠1型糖尿病模型中Foxp3的表達(dá)量稍升高,仍不能使CD4+CD25+Treg與CD4+T細(xì)胞的比值保持平衡而來(lái)抑制效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞的增殖。
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【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類(lèi)號(hào)】：R587.1;R392

【參考文獻(xiàn)】

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1 譚志平,黃亮群,鄭多,房海燕,夏昆,夏家輝;p11融合蛋白表達(dá)、純化及抗血清的制備[J];湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2002年03期

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本文編號(hào)：2347730