【摘要】： 目的:通過實(shí)驗(yàn)篩選合適的細(xì)胞外基質(zhì),利用腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cells VECs)、細(xì)胞外基質(zhì)與神經(jīng)干神胞(neural stem cells NSCs)共同構(gòu)建神經(jīng)干細(xì)胞共移植體,以提高移植神經(jīng)干細(xì)胞存活和定向分化為神經(jīng)元,減少其凋亡。 方法:實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)部分。一是利用無血清培養(yǎng)和細(xì)胞克隆培養(yǎng)技術(shù),從新生Wistar大鼠(1-3d)海馬分離NSCs,進(jìn)行體外擴(kuò)增培養(yǎng)、傳代,采用免疫組織化學(xué)法和熒光法做nestin染色鑒定;利用M199培養(yǎng)基,從新生1-7d Wistar大鼠大腦中分離腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞,進(jìn)行體外擴(kuò)增培養(yǎng),采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定;選用不同的細(xì)胞外基質(zhì)包括多聚賴氨酸(poly-L-Lysine),層粘連蛋白(LN)、Matrigel與兩種細(xì)胞進(jìn)行貼壁共培養(yǎng),鏡下觀察與三組細(xì)胞外基質(zhì)共培養(yǎng)NSCs的存活、增殖、分化情況;采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法觀察不同時(shí)間點(diǎn)(3d、7d、14d)NSCs定向分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞情況及NSCs增殖、凋亡情況。二是NSCs共移植體構(gòu)建及檢測(cè):將傳代的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞用0.25%胰酶消化20min后,以3×10~7L~(-10的密度接種在培養(yǎng)瓶中,12h貼壁后吸出腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液,涂以一層細(xì)胞外基質(zhì)后,接種經(jīng)0.125%胰酶消化20 min后吹打成單細(xì)胞NSCs懸液,密度為6×10~8L~(-1),加入NSCs完全培養(yǎng)液。培養(yǎng)3-6h鏡下觀察NSCs完全貼壁后,吸出培養(yǎng)液,再涂以一薄層細(xì)胞外基質(zhì),再接種以上相同密度的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞,加入NSCs完全培養(yǎng)液,共培養(yǎng)12-24h,形成分層結(jié)構(gòu)(VECs-細(xì)胞外基質(zhì)-NSCs-細(xì)胞外基質(zhì)-VECs),經(jīng)適力吹打形成NSCs共移植體,利用免疫熒光的方法,以Ⅷ因子標(biāo)記物標(biāo)記腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞,用nestin標(biāo)記NSCs,檢測(cè)共移植體。將不同基質(zhì)構(gòu)建的共移植體接種于放有蓋玻片的六孔板中,加入神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液,在3d、7d、14d鏡下觀察共移植體的生長(zhǎng)情況。 結(jié)果: 1、NSCs和VECs形態(tài)學(xué)觀察及鑒定:原代分離的單NSC 4d增生為神經(jīng)細(xì)胞球,傳代后,經(jīng)nestin免疫熒光染色,細(xì)胞球呈陽(yáng)性;原代培養(yǎng)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞6-8d長(zhǎng)滿瓶壁,細(xì)胞呈多角形或扁平梭形,核卵圓形,VIII因子相關(guān)抗原陽(yáng)性。 2、三種細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)NSCs分化影響:3d時(shí)MAP2免疫組化陽(yáng)細(xì)胞數(shù),由層粘連蛋白參與的共培養(yǎng)明顯高于由Matrigel、多聚賴氨酸參與的共培養(yǎng)(P0.05);7d時(shí)差距更加明顯(P0.01);14d時(shí)LN組高于Matrigel組差距不時(shí)顯,且兩者明顯高于多聚賴氨酸組(P0.01)。3d時(shí)GFAP免疫組化陽(yáng)細(xì)胞數(shù),由層粘連蛋白參與的共培養(yǎng)高于由Matrigel、多聚賴氨酸參與的共培養(yǎng)(P0.05),7d時(shí)三組差距不明顯,14d時(shí)多聚賴氨酸組和Matrigel組差距不明顯,但兩者明顯高于LN組(P0.05)。3d、7d、14d時(shí),GFAP+ MAP_2免疫組化陽(yáng)細(xì)胞數(shù),由層粘連蛋白參與的共培養(yǎng)明顯高于由Matrigel、多聚賴氨酸參與的共培養(yǎng)(P0.01) 3、LN的細(xì)胞粘附性較好,兩種細(xì)胞參與共建細(xì)胞數(shù)較高,共移植體平均細(xì)胞數(shù)8-15個(gè),平均共移體直徑28μm,較合適體內(nèi)移植。 4、共培養(yǎng)中神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和凋亡的檢測(cè):隨著天數(shù)的增加,神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)也隨之增加,但3d時(shí),LN組和Matrigel組Brdu陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于多聚賴氨酸組(P0.05),7d時(shí)Brdu陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)各組均增多,但LN組和Matrigel組Brdu陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于多聚賴氨酸組(P0.01),14d時(shí)各組細(xì)胞增殖明顯,LN組和Matrigel組Brdu陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于多聚賴氨酸組(P0.01);在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)(3d、7d、14d)可見LN組和Matrigel組Caspase/Brdu雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯低于多聚賴氨酸組。 5、共移植體活細(xì)胞鏡下所見及免疫熒光結(jié)果:通過分層貼壁共培養(yǎng)和適力吹打可以形成LN、VECs和NSCs特征性結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)以VECs和NSCs緊密相貼或VECs半包NSCs為等征。鏡下可見共移植體細(xì)胞團(tuán)不規(guī)則,NSCs被腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞包繞或相互連貼,腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞核大,胞體不規(guī)則,明顯大于NSCs,NSCs折光性強(qiáng)。在200倍視野下,隨機(jī)選取100個(gè)共移植體進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),可見平均細(xì)胞數(shù)為8-15個(gè),其中腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)平均2.8個(gè)。免疫熒光可見紅色VIII因子陽(yáng)性VECs包被綠色nestin陽(yáng)性NSCs,或相互粘貼。 結(jié)論: 1.層粘連蛋白具有良好的細(xì)胞粘附性,可使神經(jīng)干細(xì)胞與腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞間很好的粘附,可形成大小適中的神經(jīng)干細(xì)胞共移植體。 2.層粘連蛋白較多聚賴氨酸和Matrigel有更好的促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化的能力,并誘導(dǎo)其定向分化為神經(jīng)元;從而使神經(jīng)干細(xì)胞分化為膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)較少,有利于共移植體植入體內(nèi)發(fā)揮神經(jīng)替代作用。 3.層粘連蛋白能提高神經(jīng)干細(xì)胞存活,促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和內(nèi)皮細(xì)胞增殖,并通過內(nèi)皮細(xì)胞間接地促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖。 4.層粘連蛋白較多聚賴氨酸和Matrigel有更好地促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化時(shí)軸突生長(zhǎng)的作用,并且可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的遷移。 5.層粘連蛋白是構(gòu)建神經(jīng)干細(xì)胞共移植體較理想的細(xì)胞外基質(zhì),以腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞為支持細(xì)胞,以層粘連蛋白為細(xì)胞外基質(zhì),經(jīng)分層立體共培養(yǎng)(VECs-LN-NSCs-LN-VECs),適力吹打可以成功構(gòu)建適合體內(nèi)移植的神經(jīng)干細(xì)胞共移植體。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：佳木斯大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：2347146