【摘要】： 機(jī)體在各種應(yīng)激或某些藥物的影響下糖皮質(zhì)激素-糖皮質(zhì)激素受體(GC-GR)效應(yīng)會(huì)發(fā)生顯著的改變。而熱休克蛋白90(Heat shock protein 90,HSP90)是體內(nèi)普遍存在、高度保守的一類(lèi)分子伴侶蛋白,也是GC-GR效應(yīng)中的重要伴侶蛋白。正常情況下熱休克蛋白90與糖皮質(zhì)激素受體以及其他伴侶蛋白如HSP70、HIP、HOP、HSP40結(jié)合形成多聚體,使受體形成適合配體糖皮質(zhì)激素結(jié)合的活性結(jié)構(gòu),當(dāng)配體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)和受體特異結(jié)合,熱休克蛋白就從復(fù)合物中解離出來(lái),GC-GR復(fù)合物便進(jìn)入核內(nèi)發(fā)揮其生物效應(yīng)。因此,熱休克蛋白90作為Gc-GR效應(yīng)通路中關(guān)鍵環(huán)節(jié),其結(jié)構(gòu)和數(shù)量的變化將會(huì)影響糖皮質(zhì)激素生物效應(yīng)的發(fā)揮。 研究表明同系不同株的小鼠BALB/C和C57BL/6不但在創(chuàng)傷后表現(xiàn)出炎癥反應(yīng)和創(chuàng)傷修復(fù)的差異,且在耐熱、耐機(jī)械、抗輻射損傷和免疫反應(yīng)方面表現(xiàn)出顯著差異。同樣,在臨床上也可見(jiàn)到用糖皮質(zhì)激素治療的相同疾病的患者對(duì)于同樣劑量的激素治療的敏感性也有不同,有證據(jù)表明遺傳因素在這一過(guò)程中扮演重要角色,如GR的基因變異會(huì)導(dǎo)致激素治療敏感性的差異,但僅少數(shù)患者檢測(cè)到GR的基因突變。上述過(guò)程都與GC-GR效應(yīng)密切相關(guān),而HSP90是GC-GR效應(yīng)通路中的重要分子,它的變化與GC-GR效應(yīng)差異的關(guān)系引起了我們的關(guān)注。本室前期的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)C57BL/6小鼠較BALB/C具有較強(qiáng)的應(yīng)激耐受能力,隨后對(duì)其HSP84(相當(dāng)于人HSP90β)基因全長(zhǎng)進(jìn)行了測(cè)序,發(fā)現(xiàn)了4個(gè)有意義突變位點(diǎn),這是否與前面所觀察到的應(yīng)激耐受差異有關(guān)?本室對(duì)此做了進(jìn)一步研究,首先檢測(cè)了全身沖擊傷(systemic blast injury,SBI)應(yīng)激模型條件下兩品系小鼠HSP84的表達(dá)量有無(wú)差異,并將C57BL/6小鼠的HSP84基因轉(zhuǎn)入BALB/C成纖維細(xì)胞,觀察其在熱應(yīng)激后糖皮質(zhì)激素受體的核轉(zhuǎn)位變化情況。結(jié)果表明,SBI應(yīng)激條件下,兩品系小鼠的HSP84表達(dá)均有顯著升高,但品系間無(wú)顯著差異;但轉(zhuǎn)入C57BL/6小鼠的HSP84基因的BALB/C成纖維細(xì)胞較轉(zhuǎn)入BALB/C小鼠HSP84基因和轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒的同種細(xì)胞具有更強(qiáng)的核轉(zhuǎn)位能力。因此,我們推測(cè)HSP84基因的結(jié)構(gòu)變化對(duì)GC-GR效應(yīng)有顯著的影響。 由于有較多的分子參與GC-GR效應(yīng)通路,為排除其他分子的影響,本課題將以遺傳背景相似的BALB/C和C57BL/6成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象,采用熱應(yīng)激模型觀察在給予藥物阻斷熱休克蛋白90的情況下GC-GR效應(yīng)的差異及其變化,驗(yàn)證HSP90基因差異是引起應(yīng)激效應(yīng)差異的重要原因之一。同時(shí),我們將收集大批量經(jīng)糖皮質(zhì)激素治療的原發(fā)性腎病綜合征(primary nephrotic syndrome,PNS)病例,通過(guò)特異性擴(kuò)增HSP90β基因的二聚化區(qū)域和核轉(zhuǎn)位區(qū)域進(jìn)行基因測(cè)序,篩查HSP90基因突變,確定GC治療敏感和不敏感各組PNS患者各種基因型的發(fā)生率,確定基因多態(tài)性與GC治療敏感差異性的關(guān)系。 主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下: 1.采用C57BL/6和BALB/c小鼠成纖維細(xì)胞42℃熱應(yīng)激模型,該模型具有穩(wěn)定性好,致傷均一,重復(fù)性好,便于操作等優(yōu)點(diǎn),并且避免了細(xì)胞的污染。 2. C57BL/6和BALB/c小鼠成纖維細(xì)胞在42℃熱損傷情況下的細(xì)胞存活率、細(xì)胞增殖活力均較正常對(duì)照組減弱,LDH釋放增加,GR核轉(zhuǎn)位明顯增強(qiáng),并且兩品系小鼠成纖維細(xì)胞之間有顯著差異,結(jié)果表明C57BL/6小鼠成纖維細(xì)胞具有更強(qiáng)的熱損傷耐受力。 3.熱應(yīng)激小鼠成纖維細(xì)胞在給予地塞米松50nM后, C57BL/6和BALB/c小鼠成纖維細(xì)胞的損傷明顯減輕,GR核轉(zhuǎn)位明顯增強(qiáng),提示地塞米松可通過(guò)增強(qiáng)GR核轉(zhuǎn)位對(duì)熱應(yīng)激小鼠有保護(hù)作用,對(duì)C57BL/6小鼠成纖維細(xì)胞的保護(hù)作用強(qiáng)于BALB/c小鼠。 4.在給予熱應(yīng)激小鼠成纖維細(xì)胞地塞米松50nM的同時(shí)給予HSP90特異性抑制劑格爾德霉素后,地塞米松對(duì)兩品系小鼠成纖維細(xì)胞的保護(hù)作用均被減弱。較低劑量0.1uM時(shí)BALB/c小鼠成纖維細(xì)胞的損傷較C57BL/6小鼠更為嚴(yán)重,兩品系小鼠間有顯著差異。較高劑量1uM和10uM時(shí),GR核轉(zhuǎn)位明顯受阻,但兩品系小鼠成纖維細(xì)胞間僅LDH釋放有顯著差異,其余指標(biāo)無(wú)明顯差異,表明當(dāng)HSP90被完全阻斷后,兩品系小鼠成纖維細(xì)胞間的熱應(yīng)激耐受差異就消失,提示HSP90是導(dǎo)致這種差異的重要原因之一。 5.通過(guò)特異性擴(kuò)增HSP90β基因的二聚化區(qū)域和核轉(zhuǎn)位區(qū)域(6923bp-7803bp,參考Genebank Accession number:J04988)并進(jìn)行基因測(cè)序,發(fā)現(xiàn)在經(jīng)糖皮質(zhì)激素治療的腎病綜合征患者中存在2個(gè)位點(diǎn)基因變異,分別為位于intron 10的7489 CT和3’非編碼區(qū)的7612 CT基因突變。 6.在被檢測(cè)的經(jīng)糖皮質(zhì)激素治療的155例腎病綜合征患者中包括激素治療敏感患者85例和不敏感患者70例,其HSP90β基因7489 CT突變的頻率分別為2.4%和4.3%,突變位點(diǎn)多態(tài)性分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P 0.6)。HSP90β基因7612 CT突變的頻率分別為2.4%和2.9% ,突變位點(diǎn)多態(tài)性分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P 0.5)。以上結(jié)果提示HSP90β表達(dá)量與GC治療敏感性無(wú)顯著相關(guān),因?yàn)镠SP90β非翻譯區(qū)突變只影響表達(dá)量,推測(cè)HSP90β的含量變化與激素治療敏感性無(wú)關(guān),而HSP90β的結(jié)構(gòu)變化可能是引起糖皮質(zhì)激素治療敏感性差異的主要因素,但結(jié)構(gòu)差異來(lái)自基因的何處突變還需進(jìn)一步的研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類(lèi)號(hào)】：R362

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 張杰;熱休克蛋白及其生物學(xué)功能(文獻(xiàn)綜述)[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).外科學(xué)分冊(cè);2003年05期

2 馮剛,王正國(guó),楊志煥,朱佩芳,周立雄,李曉炎,寧心,肖凱,張良,蔣建新;C57BL/6和BALB/C小鼠創(chuàng)傷反應(yīng)差異性初步探討[J];中華創(chuàng)傷雜志;2001年05期

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本文編號(hào)：2341575