【摘要】：細(xì)胞死亡通路對(duì)于胚胎發(fā)育和正常組織穩(wěn)態(tài)的維持是必需的。在分子水平,細(xì)胞凋亡受到嚴(yán)格的調(diào)控。凋亡不足或過量凋亡都會(huì)引起各種疾病的發(fā)生比如:腫瘤、自體免疫性疾病或神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生。因此,細(xì)胞凋亡在生物醫(yī)藥科學(xué)研究中也已成為重要的研究領(lǐng)域。對(duì)凋亡信號(hào)通路及其調(diào)節(jié)機(jī)制的研究為各種疾病的治療提供了新的思路。 為研究谷胱甘肽合成酶類谷氨酰半胱氨酸合成酶對(duì)紫外誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞死亡的影響,本實(shí)驗(yàn)分為以下兩部分: 一:谷胱甘肽合成酶類基因的克隆與誘導(dǎo)表達(dá) 通過PCR技術(shù)從人cDNA庫(kù)中擴(kuò)增出GCLC(谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亞基)和GSS(谷胱甘肽合成酶),并分別將他們插到真核和原核質(zhì)粒的MCS位點(diǎn)中。利用這些重組載體的構(gòu)建能夠?yàn)橄乱徊窖芯縂CLC對(duì)紫外刺激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡影響做好基礎(chǔ)。構(gòu)建的原核重組載體分別用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)能夠得到大量表達(dá)的目的蛋白,也可為兩種蛋白抗體的制備做好準(zhǔn)備,從而在將來的工作里能夠有效的檢測(cè)到內(nèi)源和外源蛋白表達(dá)的變化。 二:人谷氨酰半胱氨酸合成酶防止紫外刺激誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞死亡的機(jī)制研究 人的谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)是谷胱甘肽合成的限速酶,而GCLC具有γ-GCS所有的催化活性。從形態(tài)上觀察GCLC能夠顯著地抑制紫外刺激誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞的死亡。MTS實(shí)驗(yàn)和FACS檢測(cè)的結(jié)果也表明GCLC和JNK1~(APF)的表達(dá)能夠提高細(xì)胞對(duì)紫外刺激的耐受性。通過Western blotting技術(shù)檢測(cè)到UV能夠強(qiáng)烈的激活JNK、p38和caspase-3。有趣的是,檢測(cè)結(jié)果表明GCLC能夠抑制UV誘導(dǎo)的JNK1的磷酸化,而對(duì)p38的磷酸化沒有任何影響。因此,大量表達(dá)GCLC能夠保護(hù)HEK293細(xì)胞免受紫外刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡主要是通
[Abstract]:Cell death pathways are essential for embryonic development and the maintenance of normal tissue homeostasis. At the molecular level, apoptosis is strictly regulated. Insufficient or excessive apoptosis can lead to various diseases such as tumor, autoimmune disease or neurodegenerative disease. Therefore, apoptosis has become an important research field in biomedical science. The study of apoptotic signaling pathway and its regulatory mechanism provides a new idea for the treatment of various diseases. To study the effect of glutathione synthase glutamyl cysteine synthase on UV-induced death of HEK293 cells. This experiment is divided into two parts as follows: firstly, the cloning and induced expression of glutathione synthase genes were amplified from human cDNA library by PCR technique. Acylcysteine synthase catalytic subunits and GSS (glutathione synthetase), They were inserted into the MCS site of eukaryotic and prokaryotic plasmids, respectively. The construction of these recombinant vectors can provide a good basis for the further study of the effect of GCLC on UV-stimulated apoptosis. The constructed prokaryotic recombinant vectors were induced by IPTG to express a large number of expressed target proteins, which could also be prepared for the preparation of two kinds of protein antibodies. Therefore, the changes of endogenous and exogenous protein expression can be detected effectively in the future work. Second: the mechanism of human glutamyl cysteine synthase against UV-stimulated HEK293 cell death; Human glutamyl cysteine synthase (緯-GCS) is a rate-limiting enzyme for glutathione synthesis. GCLC has all the catalytic activity of 緯-GCS. Morphologically, GCLC could significantly inhibit the death of HEK293 cells induced by UV stimulation, and the expression of GCLC and JNK1~ (APF) could improve the tolerance of HEK293 cells to UV stimulation by MTS assay and FACS assay. UV can be strongly activated by JNK,p38 and caspase-3. detected by Western blotting technique Interestingly, the results showed that GCLC could inhibit the phosphorylation of JNK1 induced by UV, but had no effect on the phosphorylation of p38. Therefore, the high expression of GCLC can protect HEK293 cells from UV-induced cell death.
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：2341072