【摘要】： 造血干細(xì)胞動員和歸巢是多因素調(diào)控的過程，趨化分子和骨髓微環(huán)境在其中起著重要的調(diào)控作用。以前的研究結(jié)果表明，CD34~+造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞表達(dá)三種趨化相關(guān)分子受體：CysLT1，S1P1和CXCR4。這三種受體都屬于具有七次跨膜結(jié)構(gòu)的G蛋白耦聯(lián)受體家族(G protein coupled receptors，GPCR)。GPCRs是一大類受體蛋白超家族，參與廣泛的細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑。而造血干細(xì)胞表面表達(dá)多種GPCR受體，調(diào)控細(xì)胞生長、增殖分化等功能。CXCR4是細(xì)胞表面常見的一種趨化因子受體，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)是目前唯一己知的CXCR4配體，由骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌。LTD4屬于白三烯家族，是炎性細(xì)胞趨化因子中作用最強(qiáng)的半胱氨酰白三烯分子，主要由活化的單核細(xì)胞，肥大細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生，參與多種重要的病理生理過程。LTD4主要通過受體CysLT1發(fā)揮效應(yīng)，CysLT1受體結(jié)構(gòu)與CXCR4等多種趨化因子受體相似。1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate，S1P)是磷脂代謝過程中的一種中間產(chǎn)物，S1P既可以作為胞內(nèi)第二信使，又可以作為細(xì)胞間信號分子通過與細(xì)胞表面受體作用而發(fā)揮其廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。目前已經(jīng)克隆多種S1P受體，，分別命名為S1P1、S1P2、S1P3、S1P4、S1P5，CD34~+造血干細(xì)胞主要表達(dá)S1P1受體。由于這三種GPCR的配體都在骨髓微環(huán)境中存在，因此有可能調(diào)控造血干細(xì)胞的增殖等細(xì)胞功能。骨髓微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞能夠分泌CXCR4的配體SDF-1和CysLT1的配體LTD4，而S1P1的配體S1P可以由巨核細(xì)胞和血小板分泌。關(guān)于SDF-1對造血干細(xì)胞的趨化遷移、細(xì)胞生存等作用已有一些研究，但LTD4和S1P對造血干細(xì)胞增殖、遷移的影響及其分子機(jī)制，目前還不清楚。本課題主要以人造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞為研究對象，研究LTD4和S1P對造血干細(xì)胞的增殖、粘附等效應(yīng)的影響，并進(jìn)一步探討LTD4，S1P和SDF-1作用造血干細(xì)胞的信號傳導(dǎo)機(jī)制。 我們應(yīng)用添加造血因子的液體培養(yǎng)體系檢測LTD4對造血干細(xì)胞的增殖能力的影響。在造血因子IL-3和SCF支持下，LTD4增加了新鮮分離的人CD34~+的造血干細(xì)胞的擴(kuò)增。在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)1周后，加入不同濃度的LTD4的培養(yǎng)體系中的CD34~+細(xì)胞數(shù)量明顯高于對照組。100nMLTD4作用最強(qiáng)，在這個濃度時，能使細(xì)胞數(shù)量與對照組相比增長69.47±3.01％。LTD4和不同的細(xì)胞因子組合結(jié)果發(fā)現(xiàn)LTD4在與IL-3聯(lián)合應(yīng)用時對造血干細(xì)胞的增殖能力最強(qiáng)。 為進(jìn)一步確定LTD4在骨髓微環(huán)境的功能，我們應(yīng)用高效液相色譜(HPLC)和較為敏感的酶標(biāo)免疫分析方法檢測骨髓內(nèi)皮細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞合成和分泌LTD4的能力。在每1×10~6骨髓內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)體系中，我們檢測到LTD4濃度為6.05±1.95nM。而在同等數(shù)量的骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)體系中，我們檢測到5.11±1.12nMLTD4。由于LTD4可以快速轉(zhuǎn)變?yōu)長TC4，并可以接著代謝為LTE4，這三種白三烯總和濃度在骨髓內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清可達(dá)21.35±5.25nM，在骨髓基質(zhì)細(xì)胞中可達(dá)18.27±4.13nM。如前面的結(jié)果所示，LTD4在濃度較低的1nM時就可以引起人造血干細(xì)胞的明顯增殖，提示骨髓基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分泌的LTD4足已在體內(nèi)發(fā)揮相應(yīng)的生理作用。而在去除造血干細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞和骨髓內(nèi)皮細(xì)胞上清中，半胱氨酰白三烯濃度明顯減少。這表明造血干細(xì)胞可以影響骨髓微環(huán)境中的骨髓基質(zhì)細(xì)胞和骨髓內(nèi)皮細(xì)胞的白三烯合成分泌或代謝。 為研究S1P對造血干細(xì)胞粘附能力的影響，我們檢測了新鮮分離的人CD34~+造血干細(xì)胞的粘附能力。從人臍血分離的HUVEC接種于96孔組織培養(yǎng)板，在實(shí)驗開始前用IL-1β刺激4小時。從正常供者外周血和骨髓分離的CD34~+細(xì)胞經(jīng)LTD4和未經(jīng)LTD4刺激后分別接種于96孔板，孵育相應(yīng)時間后用流式細(xì)胞術(shù)檢測粘附細(xì)胞。結(jié)果顯示，經(jīng)S1P刺激后的CD34~+細(xì)胞粘附比例明顯上升，在1μMS1P處理組中，S1P作用1和5分鐘時，粘附細(xì)胞數(shù)量達(dá)到最高，但并沒有隨著作用時間延長而增加。 S1P廣泛存在于體內(nèi)血液和骨髓中，因而我們試圖觀察S1P是否對人造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的增殖造成影響。分別使用造血刺激因子支持的液體培養(yǎng)體系和半固體培養(yǎng)基支持的集落形成試驗，檢測了S1P對人CD34~+細(xì)胞的增殖能力的作用。S1P對人造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的增殖沒有明顯的影響。在100nM到1μM的濃度，S1P作用組與對照組相比CD34~+細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)量沒有明顯的差異。 S1P作為體內(nèi)血漿中存在的脂質(zhì)介質(zhì)，可能會延長造血干細(xì)胞的生存能力，我們采用Annexin V凋亡試劑盒利用流式細(xì)胞術(shù)觀察了S1P對CD34細(xì)胞的生存能力的作用。結(jié)果顯示，在1μMS1P作用下，CD34~+的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的生存能力沒有顯著提高，不能減少CD34~+細(xì)胞的凋亡率。 我們利用Western Blot檢測了LTD4誘導(dǎo)的人CD34~+細(xì)胞信號傳導(dǎo)分子的活化情況。MAPK是常見的增殖相關(guān)分子，LTD4對MAP Kinase信號分子磷酸化的研究結(jié)果顯示，在新鮮分離的人CD34~+細(xì)胞和CD34~+的人白血病細(xì)胞系KG1a中，LTD4都顯著增加了MAPK(ERK1/2)的磷酸化水平。在KG1a細(xì)胞中，LTD4能在一分鐘內(nèi)快速增強(qiáng)ERK1/2的磷酸化，在5分鐘左右恢復(fù)到接近正常水平。LTD4同樣可以活化人CD34~+原代細(xì)胞MAP kinase。PI3K-Akt信號途徑是影響細(xì)胞存活的重要途徑之一，因此我們也檢測了LTD4對Akt信號的影響，結(jié)果顯示LTD4沒有誘導(dǎo)Akt信號活化。 為了進(jìn)一步了解和比較這三種趨化因子及其受體的信號傳導(dǎo)機(jī)制，我們應(yīng)用PTX觀察信號傳導(dǎo)途徑中細(xì)胞表面受體偶聯(lián)的G蛋白的作用。PTX是常用的研究信號傳導(dǎo)工具，對特定的G蛋白亞單位有阻斷作用。在刺激細(xì)胞之前，加入100ng/ml的PTX預(yù)孵育過夜。結(jié)果顯示，在PTX預(yù)孵育細(xì)胞組，SDF-1誘導(dǎo)的MAP kinase磷酸化幾乎完全被阻斷。而在CD34~+細(xì)胞中，加入PTX作用組，LTD4引起的MAP Kinase磷酸化只能部分地被抑制。這提示LTD4通過CysLT1通過活化至少兩種不同PTX-敏感Gi蛋白和非PTX敏感的G蛋白(主要是Gq蛋白)途徑活化MAPK信號。 鈣離子是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使分子，我們采用Fluo-3/AM試劑利用流式細(xì)胞儀檢測了細(xì)胞內(nèi)鈣離子的釋放。結(jié)果顯示，在從外周血或骨髓分離的CD34~+細(xì)胞中，LTD4引起的鈣離子信號明顯強(qiáng)于SDF-1誘導(dǎo)的鈣離子動員。經(jīng)過PTX作用后，SDF-1誘導(dǎo)的鈣離子信號幾乎完全被阻斷，接近于起始水平。而PTX只能部分地降低LTD4引起的細(xì)胞內(nèi)鈣離子動員。 Pyk2分子是參與調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動的重要信號分子之一，同時也與多種信號途徑相關(guān)聯(lián)。我們應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測了Pyk2信號分子的磷酸化水平。結(jié)果表明，LTD4與SDF-1都能夠活化Pyk2分子，誘導(dǎo)Pyk2分子磷酸化。由于S1P也參與調(diào)控人造血干細(xì)胞的運(yùn)動，因此同時檢測了S1P對Pyk2信號的影響，發(fā)現(xiàn)S1P同樣可以活化Pyk2信號分子。進(jìn)一步應(yīng)用PTX，觀察不同G蛋白對Pyk2信號途徑的作用。結(jié)果顯示，PTX能夠部分的阻斷LTD4引起的Pyk2信號活化，但可以完全阻斷S1P和SDF-1引起的Pyk2信號激活。 肌動蛋白聚合(Actin polymerization)是細(xì)胞移動的關(guān)鍵步驟，因而被常用來做為檢測細(xì)胞運(yùn)動的指標(biāo)之一。在細(xì)胞經(jīng)LTD4(1μM)和SDF-1(100ng/ml)處理后，我們采用流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞肌動蛋白改變。結(jié)果顯示，SDF-1能快速引起的人CD34~+細(xì)胞肌動蛋白聚合，在10秒鐘達(dá)到最高點(diǎn)，隨后迅速下降，在2分鐘左右恢復(fù)到起始水平。在PTX預(yù)先作用組，細(xì)胞內(nèi)的肌動蛋白聚合與對照組相比無顯著變化，說明SDF-1誘導(dǎo)的肌動蛋白聚合幾乎可以被PTX完全阻斷，主要是Gai蛋白參與SDF-1誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移。LTD4能夠快速誘導(dǎo)人CD34~+細(xì)胞肌動蛋白聚合，在1μMLTD4作用細(xì)胞5秒后，細(xì)胞內(nèi)F-actin增加約55％，隨后在2分鐘左右解聚到起始水平。與SDF-1不同的是，LTD4誘導(dǎo)的細(xì)胞肌動蛋白聚合只能部分的被PTX抑制，說明PTX敏感Gi和非敏感G蛋白都有參與LTD4誘導(dǎo)的細(xì)胞運(yùn)動。 結(jié)論： 1．在CD34~+造血干細(xì)胞中表達(dá)CysLT1受體分子，骨髓基質(zhì)細(xì)胞能夠合成和分泌LTD4，LTD4能夠通過CysLT1受體刺激人CD34~+造血干細(xì)胞增殖。 2．S1P作為一種脂質(zhì)介質(zhì)，能夠增加CD34~+造血干細(xì)胞粘附，但不影響人CD34~+細(xì)胞的增殖能力和生存能力。 3．LTD4能夠通過不同的G蛋白(Gi和Gq等)介導(dǎo)活化造血干細(xì)胞的MAPK信號分子、鈣離子信號和Pyk2信號分子，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖等效應(yīng)。 4．PTX敏感G蛋白(Gi蛋白)和非PTX敏感蛋白(主要為Gq蛋白)都參與LTD4通過受體CysLT1誘導(dǎo)的CD34~+造血干細(xì)胞效應(yīng)，而SDF-1/CXCR4只活化Gi蛋白介導(dǎo)的信號途徑。 5．在人CD34~+造血干細(xì)胞中，CysLT1介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流和細(xì)胞增殖都明顯強(qiáng)于 CXCR4介導(dǎo)的細(xì)胞效應(yīng)，這可能與Gi蛋白和Gq蛋白都參與CysLT1介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)，而CXCR4和S1P1只活化Gi蛋白介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R363

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前6條

1 李忠俊;陳幸華;;白血病原代骨髓基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞基因差異表達(dá)研究[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2006年14期

2 梁蓉,黃高升,王哲,馮驥良,郭英,楊國嶸;正常人骨髓成纖維樣基質(zhì)細(xì)胞系對白血病細(xì)胞U937增殖的影響[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2003年17期

3 王震,李揚(yáng)秋,吳秀麗,楊力建,陳少華,張洹,朱康兒,韓忠朝;SCL基因在白血病患者骨髓基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)[J];中國實(shí)驗血液學(xué)雜志;2004年01期

4 莊俊玲;汪玄;張潔萍;武永吉;;多發(fā)性骨髓瘤、急性白血病患者骨髓基質(zhì)細(xì)胞的生長、免疫表型及白介素6的水平[J];中國實(shí)驗血液學(xué)雜志;2006年04期

5 宋陸茜;郭娟;賀琪;許峰;楊蓮萍;李曉;常春康;;骨髓增生異常綜合征患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞遺傳學(xué)異常的研究[J];中國實(shí)驗血液學(xué)雜志;2011年02期

6 王震,李揚(yáng)秋,吳秀麗,陳少華,楊力建,張洹,朱康兒,韓忠朝;干細(xì)胞白血病基因在再障和正常骨髓基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)[J];中國病理生理雜志;2005年01期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前3條

1 梁蓉;正常人骨髓成纖維樣基質(zhì)細(xì)胞系對急性髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞增殖、分化和凋亡的影響[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2004年

2 龐全海;山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及體外分化潛能的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2005年

3 莊俊玲;骨髓基質(zhì)細(xì)胞和黏附分子對骨髓瘤細(xì)胞生長的影響作用初探[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2004年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前3條

1 宋陸茜;骨髓增生異常綜合征患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞遺傳學(xué)特征的研究[D];蘇州大學(xué);2011年

2 王震;SCL、KDR和Sema3基因在白血病和再障骨髓基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)[D];暨南大學(xué);2003年

3 魏立;阻抑骨髓基質(zhì)SDF-1作用對HL-60細(xì)胞增殖、凋亡及藥物敏感性的影響[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2004年

本文編號：2338287