發(fā)布時間：2018-11-10 13:11

【摘要】： 鼻咽癌是中國南方高發(fā)的腫瘤，具有人種和人群的易感性、家族聚集現(xiàn)象、低分化和高轉移為主的臨床病理特征，并與EB病毒高度相關。其中EB病毒編碼的潛伏膜蛋白LMP1是重要的致瘤蛋白，以鼻咽癌為切入點，我們多年的研究工作一直致力于LMP1介導的信號轉導通路的研究。從建立LMP1可調控表達體系入手，以細胞內重要的信號轉導分子NF-κB、AP-1、STAT作為樞紐，系統(tǒng)地研究了LMP1介導的信號轉導通路異常以及由此產(chǎn)生的一系列生物學效應。 p53是重要的抑瘤基因，作為細胞基因組穩(wěn)定性的“守護神”(guardian)，p53蛋白對細胞的存活具有雙面性(double faces)：p53通過作用于受損細胞的細胞周期限制點，延緩細胞周期行進，以使細胞在DNA復制和細胞分裂前修復DNA損傷保證細胞高質量存活；但當DNA損傷超過細胞的修復能力時，則促使細胞進入凋亡。在50％以上的人類腫瘤中存在有p53的突變，p53功能的喪失是人類腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中常見的分子事件。 與其他腫瘤細胞不同的是，在鼻咽癌中p53基因的突變頻率很低(＜10％)，且出現(xiàn)了p53蛋白積聚的現(xiàn)象。臨床樣本的檢測發(fā)現(xiàn)p53的過表達與鼻咽癌的發(fā)病密切相關，p53的表達在鼻咽癌組織和癌旁組織中顯著的相關性提示p53的過表達出現(xiàn)在鼻咽癌癌變的早期發(fā)展階段，且隨著鼻咽癌病程的發(fā)展，p53的陽性表達率及表達強度均增加，與淋巴結的轉移也具有一定的相關性。在構建的LMP1轉基因小鼠中也發(fā)現(xiàn)p53的積聚現(xiàn)象。這些結果強烈提示我們：p53在鼻咽癌發(fā)生和發(fā)展過程中可能具有功能活性。 我們前期的研究工作發(fā)現(xiàn)病毒致瘤蛋白LMP1通過調節(jié)p53表達的增加，導致細胞G_2／M期行進過程中重要的正性調節(jié)因子cdc2／cyclin B1復合物激酶活性下降，使其停滯于G_2／M期。這提示我們p53作為一個受EB病毒LMP1調控的關鍵轉錄因子在細胞周期調節(jié)中具有重要的功能。除此之外，已有研究表明LMP1通過p53上調抗凋亡基因A20，Bcl-2，，Survivin和△NP63抑制凋亡的發(fā)生。故LMP1介導p53增加而不誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，LMP1通過調節(jié)p53從而穩(wěn)定EB病毒的潛伏感染，促進上皮細胞的轉化，有助于宿主和病毒之間平衡的維持。這為我們從一個新的視野來研究和理解p53在EB病毒感染中的病理生理學意義提供了新的啟示。 一直以來，關于EB病毒轉化作用的研究都是在非鼻咽上皮來源和非上皮細胞來源的細胞中進行的，EB病毒感染和其編碼的致瘤蛋白LMP1所參與的信號轉導通路的研究局限于腫瘤細胞中完成，不能充分闡明癌變多階段演進過程中的分子機理以及遺傳因素和環(huán)境因素在癌變過程中的相互作用關系。在國家自然科學基金委與香港研究資助局聯(lián)合科研資助基金(No．30418004)的資助下，我們引進了體外處于癌變早期階段的實驗模型平臺：NP69、轉染了空白載體pLNSX的NP69-pLNSX和轉染了LMP1的NP69-LMP1細胞模型。因此，利用永生化的鼻咽上皮NP69細胞模型探討腫瘤的發(fā)病機理是一個很好的切入點。我們首先對NP69細胞模型中p53的特征進行了研究，在該模型中證實有大量游離的、野生型的p53的存在，且LMP1不僅能促進p53的核積聚，同時還促進p53的轉錄活性和蛋白水平的表達。這為我們進一步利用該細胞模型研究致瘤蛋白LMP1調節(jié)p53功能活化的分子機制提供了重要的基礎。 p53翻譯后修飾是其最主要的激活機制，其中一個重要的機制是磷酸化。近年來p53磷酸化對p53的功能活化取得了新的進展。已有將近18個p53的磷酸化位點得到闡明，它們分別位于p53功能結構域的N端、核心區(qū)和C末端，其中以N末端和C末端較為集中，不同的磷酸化位點參與p53轉錄活性、穩(wěn)定性和抗凋亡功能的調節(jié)。但病毒致瘤蛋白LMP1對p53磷酸化的調節(jié)尚不清楚。從眾多的p53磷酸化位點中，我們選取了N末端具有代表性的p53 Ser15、Ser20和Thr81，以及C末端的Ser392作為研究對象，來闡明p53的功能活性。 蛋白的磷酸化需要一種或多種蛋白激酶的作用。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路是由一組級聯(lián)活化的絲／蘇氨酸蛋白激酶組成，主要包括ERK1／2、JNK和p38激酶通路，MAPK對于細胞周期的運行和基因表達具有重要調控作用。已有研究表明在UV或DNA損傷等外界環(huán)境因素的刺激下，MAPK通路的活化能使p53多位點磷酸化。新近研究證實MAPK信號級聯(lián)通路在LMP1介導的腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用。因此從翻譯后修飾-磷酸化的水平來研究在LMP1的作用下p53激活的分子機制將為我們深入了解LMP1致瘤的病理生理功能提供重要的啟示。 利用NP69細胞模型為材料，通過本研究發(fā)現(xiàn)，LMP1能顯著促進p53 Ser 15、Ser 20、Ser 392和Thr 81位的磷酸化，進一步確定LMP1主要通過ERK1／2信號通路調節(jié)p53 Ser 15位的磷酸化；通過JNK信號通路調節(jié)p53 Ser 20位和Thr 81位的磷酸化；通過p38信號通路調節(jié)p53 Ser 392位和Ser 15位的磷酸化。其中LMP1通過JNK信號通路調節(jié)p53 Ser 20位的磷酸化程度最為顯著，而p53 Ser 15位的磷酸化以ERK1／2信號通路調節(jié)為主，這提示LMP1所致的JNK信號通路的激活在p53磷酸化的調控中是一條重要的信號。進一步我們證明，LMP1所致的MAPK多條通路的異常激活導致p53多個位點的磷酸化，使p53轉錄活性增加，同時影響下游基因p21、MDM2蛋白水平的表達，促進反式激活能力的增強。這些科學發(fā)現(xiàn)為闡明LMP1通過調節(jié)p53的磷酸化參與p53的功能活化提供了新的實驗證據(jù)。 p53翻譯后修飾的另一個重要機制是泛素化，細胞外信號嚴格調控著目的蛋白的泛素化，而這種調控依賴于蛋白的磷酸化。蛋白的泛素化和磷酸化協(xié)同作用，相輔相成，精確調控細胞內的信號轉導通路。p53的降解是泛素化依賴性的，主要受MDM2的介導。MDM2具有泛素連接酶(E3)的作用。我們的研究表明，EB病毒LMP1能減少MDM2與p53的結合能力，由此我們推測LMP1有可能通過泛素化的途徑參與p53的功能活化。 目前對泛素化的研究主要集中于Lys 48和Lys 63。與Lys 48結合的多泛素鏈(Ubk48)，作為一種信號，介導泛素修飾底物進入26S蛋白酶體，執(zhí)行降解功能；與Lys 63結合的多泛素鏈(Ubk63)介導的泛素化在DNA損傷修復、炎癥反應、胞吞作用和核糖體蛋白的合成中起重要作用，而不依賴于經(jīng)典的蛋白酶體的途徑。通過本研究，我們發(fā)現(xiàn)LMP1通過MAPK信號通路調節(jié)p53的磷酸化介導Ubk63泛素分子和p53的結合，尤以JNK通路介導的p53 Ser 20、Thr 81位的磷酸化對其泛素化的調節(jié)最為顯著，這與p53的穩(wěn)定性和功能活性的調節(jié)密切相關。而p53的磷酸化能抑制Ubk48與p53的結合，促進p53穩(wěn)定性的調節(jié)。因此，泛素分子Ubk48和Ubk63可能通過與p53的結合，執(zhí)行不同的功能，在LMP1所致的p53中發(fā)揮重要功能。 綜上所述，本研究證實了EB病毒致瘤病毒LMP1調節(jié)p53的組成性磷酸化譜，明確了LMP1調節(jié)p53磷酸化的關鍵激酶，即MAPK信號通路，提出了工作模式圖，證明了p53是受LMP1調控的重要轉錄因子，建立了LMP1→MAPK→p53的信號轉導通路，證明了磷酸化是調節(jié)p53轉錄活性、反式激活和穩(wěn)定性的重要修飾方式，確定了LMP1通過MAPK信號通路調節(jié)p53磷酸化與泛素化之間的相關性。 因此，本研究首次從翻譯后修飾—磷酸化和泛素化的角度闡明了EB病毒重要的致瘤蛋白LMP1調節(jié)p53的功能活性，這為闡明p53在鼻咽癌癌變過程中的重要生物學作用提供了重要的實驗依據(jù)，為全面理解LMP1的致瘤功能提供了新的理論依據(jù)和開拓了新的視野，最終為鼻咽癌和EB病毒相關其它腫瘤抗癌藥物和基因治療靶點的選擇創(chuàng)造了條件。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R373;R739.63

【參考文獻】

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本文編號：2322566