【摘要】： 鼻咽癌是中國南方高發(fā)的腫瘤，具有人種和人群的易感性、家族聚集現(xiàn)象、低分化和高轉(zhuǎn)移為主的臨床病理特征，并與EB病毒高度相關(guān)。其中EB病毒編碼的潛伏膜蛋白LMP1是重要的致瘤蛋白，以鼻咽癌為切入點，我們多年的研究工作一直致力于LMP1介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究。從建立LMP1可調(diào)控表達體系入手，以細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子NF-κB、AP-1、STAT作為樞紐，系統(tǒng)地研究了LMP1介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常以及由此產(chǎn)生的一系列生物學(xué)效應(yīng)。 p53是重要的抑瘤基因，作為細(xì)胞基因組穩(wěn)定性的“守護神”(guardian)，p53蛋白對細(xì)胞的存活具有雙面性(double faces)：p53通過作用于受損細(xì)胞的細(xì)胞周期限制點，延緩細(xì)胞周期行進，以使細(xì)胞在DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂前修復(fù)DNA損傷保證細(xì)胞高質(zhì)量存活；但當(dāng)DNA損傷超過細(xì)胞的修復(fù)能力時，則促使細(xì)胞進入凋亡。在50％以上的人類腫瘤中存在有p53的突變，p53功能的喪失是人類腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中常見的分子事件。 與其他腫瘤細(xì)胞不同的是，在鼻咽癌中p53基因的突變頻率很低(＜10％)，且出現(xiàn)了p53蛋白積聚的現(xiàn)象。臨床樣本的檢測發(fā)現(xiàn)p53的過表達與鼻咽癌的發(fā)病密切相關(guān)，p53的表達在鼻咽癌組織和癌旁組織中顯著的相關(guān)性提示p53的過表達出現(xiàn)在鼻咽癌癌變的早期發(fā)展階段，且隨著鼻咽癌病程的發(fā)展，p53的陽性表達率及表達強度均增加，與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移也具有一定的相關(guān)性。在構(gòu)建的LMP1轉(zhuǎn)基因小鼠中也發(fā)現(xiàn)p53的積聚現(xiàn)象。這些結(jié)果強烈提示我們：p53在鼻咽癌發(fā)生和發(fā)展過程中可能具有功能活性。 我們前期的研究工作發(fā)現(xiàn)病毒致瘤蛋白LMP1通過調(diào)節(jié)p53表達的增加，導(dǎo)致細(xì)胞G_2／M期行進過程中重要的正性調(diào)節(jié)因子cdc2／cyclin B1復(fù)合物激酶活性下降，使其停滯于G_2／M期。這提示我們p53作為一個受EB病毒LMP1調(diào)控的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中具有重要的功能。除此之外，已有研究表明LMP1通過p53上調(diào)抗凋亡基因A20，Bcl-2，，Survivin和△NP63抑制凋亡的發(fā)生。故LMP1介導(dǎo)p53增加而不誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，LMP1通過調(diào)節(jié)p53從而穩(wěn)定EB病毒的潛伏感染，促進上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，有助于宿主和病毒之間平衡的維持。這為我們從一個新的視野來研究和理解p53在EB病毒感染中的病理生理學(xué)意義提供了新的啟示。 一直以來，關(guān)于EB病毒轉(zhuǎn)化作用的研究都是在非鼻咽上皮來源和非上皮細(xì)胞來源的細(xì)胞中進行的，EB病毒感染和其編碼的致瘤蛋白LMP1所參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究局限于腫瘤細(xì)胞中完成，不能充分闡明癌變多階段演進過程中的分子機理以及遺傳因素和環(huán)境因素在癌變過程中的相互作用關(guān)系。在國家自然科學(xué)基金委與香港研究資助局聯(lián)合科研資助基金(No．30418004)的資助下，我們引進了體外處于癌變早期階段的實驗?zāi)Ｐ推脚_：NP69、轉(zhuǎn)染了空白載體pLNSX的NP69-pLNSX和轉(zhuǎn)染了LMP1的NP69-LMP1細(xì)胞模型。因此，利用永生化的鼻咽上皮NP69細(xì)胞模型探討腫瘤的發(fā)病機理是一個很好的切入點。我們首先對NP69細(xì)胞模型中p53的特征進行了研究，在該模型中證實有大量游離的、野生型的p53的存在，且LMP1不僅能促進p53的核積聚，同時還促進p53的轉(zhuǎn)錄活性和蛋白水平的表達。這為我們進一步利用該細(xì)胞模型研究致瘤蛋白LMP1調(diào)節(jié)p53功能活化的分子機制提供了重要的基礎(chǔ)。 p53翻譯后修飾是其最主要的激活機制，其中一個重要的機制是磷酸化。近年來p53磷酸化對p53的功能活化取得了新的進展。已有將近18個p53的磷酸化位點得到闡明，它們分別位于p53功能結(jié)構(gòu)域的N端、核心區(qū)和C末端，其中以N末端和C末端較為集中，不同的磷酸化位點參與p53轉(zhuǎn)錄活性、穩(wěn)定性和抗凋亡功能的調(diào)節(jié)。但病毒致瘤蛋白LMP1對p53磷酸化的調(diào)節(jié)尚不清楚。從眾多的p53磷酸化位點中，我們選取了N末端具有代表性的p53 Ser15、Ser20和Thr81，以及C末端的Ser392作為研究對象，來闡明p53的功能活性。 蛋白的磷酸化需要一種或多種蛋白激酶的作用。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路是由一組級聯(lián)活化的絲／蘇氨酸蛋白激酶組成，主要包括ERK1／2、JNK和p38激酶通路，MAPK對于細(xì)胞周期的運行和基因表達具有重要調(diào)控作用。已有研究表明在UV或DNA損傷等外界環(huán)境因素的刺激下，MAPK通路的活化能使p53多位點磷酸化。新近研究證實MAPK信號級聯(lián)通路在LMP1介導(dǎo)的腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用。因此從翻譯后修飾-磷酸化的水平來研究在LMP1的作用下p53激活的分子機制將為我們深入了解LMP1致瘤的病理生理功能提供重要的啟示。 利用NP69細(xì)胞模型為材料，通過本研究發(fā)現(xiàn)，LMP1能顯著促進p53 Ser 15、Ser 20、Ser 392和Thr 81位的磷酸化，進一步確定LMP1主要通過ERK1／2信號通路調(diào)節(jié)p53 Ser 15位的磷酸化；通過JNK信號通路調(diào)節(jié)p53 Ser 20位和Thr 81位的磷酸化；通過p38信號通路調(diào)節(jié)p53 Ser 392位和Ser 15位的磷酸化。其中LMP1通過JNK信號通路調(diào)節(jié)p53 Ser 20位的磷酸化程度最為顯著，而p53 Ser 15位的磷酸化以ERK1／2信號通路調(diào)節(jié)為主，這提示LMP1所致的JNK信號通路的激活在p53磷酸化的調(diào)控中是一條重要的信號。進一步我們證明，LMP1所致的MAPK多條通路的異常激活導(dǎo)致p53多個位點的磷酸化，使p53轉(zhuǎn)錄活性增加，同時影響下游基因p21、MDM2蛋白水平的表達，促進反式激活能力的增強。這些科學(xué)發(fā)現(xiàn)為闡明LMP1通過調(diào)節(jié)p53的磷酸化參與p53的功能活化提供了新的實驗證據(jù)。 p53翻譯后修飾的另一個重要機制是泛素化，細(xì)胞外信號嚴(yán)格調(diào)控著目的蛋白的泛素化，而這種調(diào)控依賴于蛋白的磷酸化。蛋白的泛素化和磷酸化協(xié)同作用，相輔相成，精確調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。p53的降解是泛素化依賴性的，主要受MDM2的介導(dǎo)。MDM2具有泛素連接酶(E3)的作用。我們的研究表明，EB病毒LMP1能減少MDM2與p53的結(jié)合能力，由此我們推測LMP1有可能通過泛素化的途徑參與p53的功能活化。 目前對泛素化的研究主要集中于Lys 48和Lys 63。與Lys 48結(jié)合的多泛素鏈(Ubk48)，作為一種信號，介導(dǎo)泛素修飾底物進入26S蛋白酶體，執(zhí)行降解功能；與Lys 63結(jié)合的多泛素鏈(Ubk63)介導(dǎo)的泛素化在DNA損傷修復(fù)、炎癥反應(yīng)、胞吞作用和核糖體蛋白的合成中起重要作用，而不依賴于經(jīng)典的蛋白酶體的途徑。通過本研究，我們發(fā)現(xiàn)LMP1通過MAPK信號通路調(diào)節(jié)p53的磷酸化介導(dǎo)Ubk63泛素分子和p53的結(jié)合，尤以JNK通路介導(dǎo)的p53 Ser 20、Thr 81位的磷酸化對其泛素化的調(diào)節(jié)最為顯著，這與p53的穩(wěn)定性和功能活性的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。而p53的磷酸化能抑制Ubk48與p53的結(jié)合，促進p53穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)。因此，泛素分子Ubk48和Ubk63可能通過與p53的結(jié)合，執(zhí)行不同的功能，在LMP1所致的p53中發(fā)揮重要功能。 綜上所述，本研究證實了EB病毒致瘤病毒LMP1調(diào)節(jié)p53的組成性磷酸化譜，明確了LMP1調(diào)節(jié)p53磷酸化的關(guān)鍵激酶，即MAPK信號通路，提出了工作模式圖，證明了p53是受LMP1調(diào)控的重要轉(zhuǎn)錄因子，建立了LMP1→MAPK→p53的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，證明了磷酸化是調(diào)節(jié)p53轉(zhuǎn)錄活性、反式激活和穩(wěn)定性的重要修飾方式，確定了LMP1通過MAPK信號通路調(diào)節(jié)p53磷酸化與泛素化之間的相關(guān)性。 因此，本研究首次從翻譯后修飾—磷酸化和泛素化的角度闡明了EB病毒重要的致瘤蛋白LMP1調(diào)節(jié)p53的功能活性，這為闡明p53在鼻咽癌癌變過程中的重要生物學(xué)作用提供了重要的實驗依據(jù)，為全面理解LMP1的致瘤功能提供了新的理論依據(jù)和開拓了新的視野，最終為鼻咽癌和EB病毒相關(guān)其它腫瘤抗癌藥物和基因治療靶點的選擇創(chuàng)造了條件。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R373;R739.63

【參考文獻】

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本文編號：2322566