【摘要】： 血吸蟲病(schis tosomiasis)是全球第二大嚴重危害人類健康的寄生蟲病，我國有現(xiàn)癥患者80余萬，受威脅人口達1億。雖然經(jīng)過半個多世紀的控制努力，血吸蟲病的人群感染和流行已大大降低，但是作為一種嚴重的人獸共患病，仍有許多問題尚未解決。 控制血吸蟲病的傳播和流行需采取以吡喹酮反復群體化療，輔以滅螺等的綜合防治手段。但隨著血吸蟲的感染和反復再感染，以及吡喹酮耐藥性的出現(xiàn)，血吸蟲病疫苗的發(fā)展提到日程上來。有效的抗血吸蟲疫苗不僅能長期控制血吸蟲病，甚至可能消滅它。而闡明血吸蟲病免疫保護的機制是研制血吸蟲病疫苗的前提條件。目前，有關抗血吸蟲保護力的相關免疫學機制仍不明確。 本研究擬從誘導宿主保護性免疫應答為出發(fā)點，用生物信息學工具從不同疫苗候選分子中篩選T／B細胞表位，以粒細胞一巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)為佐劑，利用陽離子肽技術制備表位肽-核酸雙疫苗(PDDV)，并觀察單個及混合表位PDDV在小鼠體內(nèi)誘導的免疫應答，及其對小鼠抗日本血吸蟲感染、抗病理的作用，為探索日本血吸蟲病疫苗研制的新途徑和探討日本血吸蟲感染的保護性免疫機制提供有益的實驗研究資料。為此，本文進行了以下幾個方面的研究。 一、生物信息學分析、預測日本血吸蟲抗原分子表位 為了優(yōu)化疫苗的設計，分析預測日本血吸蟲病疫苗候選抗原分子中的T／B細胞表位，應用多種在線數(shù)據(jù)庫和軟件分析10個日本血吸蟲潛在疫苗候選抗原分子(Sj14，Sj97，sj14-3-3，sj22.6，sj23，sj26，Sj28，sj338，sj62，sjTPI)，預測人類基因型HLA-DRB1*0401、HLA-A*0201以及C57BL／6小鼠基因型H-2b(H-2Kb、H-2Db)的對應細胞表位，包括MHCⅠ類分子相關的CTL表位、MHCⅡ類分子相關的Th表位和抗體相關的B細胞表位。并進行蛋白酶體水解位點預測，以剔除表位遞呈至體內(nèi)可能被水解的片段。再用BLAST比對與研究對象(人／小鼠)相應蛋白分子的同源性，剔除同源性高的表位以避免自身免疫反應。最終根據(jù)10個抗原分子的T／B細胞表位的表位分析結(jié)果，表位蛋白酶體水解位點預測以及同源性比對的結(jié)果，，綜合后得到小鼠基因型的日本血吸蟲抗原分子CTL、Th和B細胞表位各3個，用于后續(xù)研究。 二、抗日本血吸蟲感染表位PDDV疫苗的構(gòu)建 為了更好的提高抗日本血吸蟲感染疫苗的效果，采取了PDDV的形式。根據(jù)研究一中預測所得的9個表位序列，在每個表位的N端加上18個賴氨酸的陽離子肽作為連接橋，合成相應的肽段，并合成帶有酶切位點的互補的表位相應DNA正負鏈。將互補DNA正負鏈退火后的片段插入雙酶切過的載體PUMVC1-mGM-CSF，構(gòu)建含抗原表位肽編碼基因的重組真核表達載體，并通過雙酶切實驗和DNA測序鑒定。測序結(jié)果顯示構(gòu)建的載體中含有相應表位肽編碼基因序列。同時構(gòu)建不同組合的CTL、Th和B表位肽編碼基因串聯(lián)的表達載體。再將含抗原表位肽DNA的質(zhì)粒與相應肽段通過正負電荷作用連接成納米大小的顆粒，構(gòu)建成Peptide-DNA Dual Vaccine(PDDV)。并對不同制備條件下的PDDV通過電泳阻滯試驗、DNaseⅠ保護性試驗和電鏡觀察對其理化特性進行鑒定，選取最優(yōu)化的條件(NaC1的濃度為150mmol／L，肽與質(zhì)粒DNA比值為4)制備表位PDDV。在這個優(yōu)化的條件下制備出的PDDV可以保護DNA不被核酸酶降解，電鏡下觀察顆粒大小均勻，直徑約15nm左右，符合抗原遞呈的要求。最終制備的含有不同表位的PDDV，用于小鼠模型的進一步研究。 三、表位PDDV在小鼠模型上的免疫學特性及免疫保護性的實驗研究 為研究表位PDDV在小鼠模型上的免疫學特性，以及在抗日本血吸蟲感染和抗病理方面的作用。將小鼠分為29組，制備好的單表位PDDV或CTL、Th、B混合表位PDDV按照每只小鼠每次100μl進行免疫，注射PBS作為對照，每2周免疫一次，共3次，末次免疫后1周剖殺6只小鼠／組，取淋巴結(jié)和脾臟細胞進行~(51)Cr釋放試驗檢測細胞殺傷力、~3H摻入法檢測細胞增殖以及ELISA檢測細胞因子IFN-γ和IL-4的檢測；取血清進行ELISA檢測抗體IgG及其亞類IgGl和IgG2a水平。在CTL表位PDDV小鼠組可見顯著的細胞殺傷效應；在Th表位PDDV組可見增高的細胞因子及細胞增殖反應；而B表位PDDV組產(chǎn)生了高水平抗體的免疫應答。其中Th表位T3和B細胞表位B3制備的PDDV的免疫應答尤為顯著。這表明PDDV可以在體內(nèi)誘導出抗原特異性的細胞免疫應答和抗體免疫應答。不同類型的表位PDDV混合后免疫小鼠的各種免疫反應并不如單表位PDDV顯著。末次免疫2周后用40條尾蚴攻擊感染，感染6周后剖殺小鼠，回收小鼠體內(nèi)成蟲進行計數(shù)；消化肝臟在顯微鏡下計數(shù)肝內(nèi)蟲卵數(shù)目，并將肝臟組織制成病理切片，觀察肝臟蟲卵肉芽腫的數(shù)目和大小。根據(jù)減蟲率、減卵率，以及病理切片觀察結(jié)果，CTL表位組PDDV未顯示出有效保護力，T3表位與B3表位PDDV可誘導小鼠產(chǎn)生部分免疫保護力。這表明Th／B表位PDDV具有抗日本血吸蟲感染和病理損害的作用。 綜上，本研究中利用生物信息學工具從不同疫苗候選分子中篩選了T／B細胞表位，以GM-CSF為佐劑，構(gòu)建了含預測表位編碼基因的真核表達載體。將載體與合成表位肽利用陽離子肽技術在最優(yōu)化的條件下制備表位肽一核酸雙疫苗(PDDV)，并觀察了單個及混合表位PDDV在小鼠體內(nèi)誘導的免疫應答，及其對小鼠抗日本血吸蟲感染、抗病理的作用。其中單個T3和B3表位PDDV免疫小鼠產(chǎn)生較高的抗血吸蟲感染的免疫保護力。這表明，血吸蟲抗原分子的表位PDDV具有一定的抗血吸蟲感染的作用，而如何提高混合或者復合表位PDDV的免疫保護效果尚有待進一步研究。
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【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R392

【參考文獻】

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1 甘燕,石佑恩,卜玲毅,朱曉華,寧長修,朱紅剛;Immune responses against Schistosoma japonicum after vaccinating mice with a multivalent DNA vaccine encoding integrated membrane protein Sj23 and cytokine interleukin-12[J];Chinese Medical Journal;2004年12期

本文編號：2321812