【摘要】： TALL-2(TNF and apoptosis ligand-related leukocyte-expressed ligand 2,TNF和凋亡配體相關(guān)的白細胞表達配體2),又名APRIL(a proliferation inducing ligand,增殖誘導(dǎo)配體),是腫瘤壞死因子(TNF)超家族的新成員之一。屬Ⅱ型跨膜蛋白,N端在胞內(nèi),C端在胞外,有膜結(jié)合型和可溶性兩種活性形式。TALL-2在正常組織中幾乎檢測不到,但是在多種類型的惡性腫瘤細胞中卻有高水平表達,并且可以在體內(nèi)、體外促進這些惡性腫瘤細胞的生長。鑒于TALL-2與腫瘤細胞之間的密切關(guān)系,設(shè)法有效抑制TALL-2的功能活性,將可能為相關(guān)腫瘤的治療提供嶄新途徑。研究表明TALL-2抗體和TALL-2的可溶性受體能夠在一定程度上抑制TALL-2的功能,但是這兩種策略都不涉及TALL-2分子本身的改變,因此我們想另辟蹊徑,通過改造TALL-2分子構(gòu)建能夠與受體結(jié)合但是不能引發(fā)受體后效應(yīng)的TALL-2突變體的方法,得到TALL-2的有效抑制劑。 在本課題組已成功克隆并表達了重組人可溶性TALL-2(soluble TALL-2,sTALL-2,編碼105-250氨基酸序列)分子的基礎(chǔ)上,借鑒Liu等人改建TALL-1 ( TNF and apoptosis ligand-related leukocyte-expressed ligand 1,又稱BLyS或BAFF )分子的方法,在與TALL-1同源序列比對以及對TALL-2分子結(jié)構(gòu)分析后,選擇TALL-2第187位作為突變位點,借助一步反向PCR致突變法構(gòu)建人sTALL-2第187Q的三個突變體,進而對sTALL-2突變體蛋白進行表達、純化及生物學(xué)活性檢測。取得的主要結(jié)果如下: 1.以pUC18/sTALL-2為模板,經(jīng)一步反向PCR法構(gòu)建了以編碼絲氨酸的TCT、編碼天冬氨酸的GAT和編碼精氨酸的CGT替換sTALL-2第187位編碼谷氨酰胺的CAA的三個突變體,分別命名為pUC18/msTALL-2-S、pUC18/msTALL-2-D和pUC18/msTALL-2-R。 2.將上述測序正確的突變型目的片段分別連接于原核表達質(zhì)粒pQE-80L,構(gòu)建了重組原核表達質(zhì)粒pQE-80L/msTALL-2-S、pQE-80L/msTALL-2-D和pQE-80L/ msTALL-2-R。 3.將上述重組原核表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),均獲得了較高水平的表達,并確立sTALL-2第187Q突變體msTALL-2-S、msTALL-2-D和msTALL-2-R在大腸桿菌中高效表達的最佳誘導(dǎo)表達條件均為終濃度1mmol/L的IPTG在37℃誘導(dǎo)表達4h。SDS-PAGE分析可見,各重組蛋白的大小均約為19kDa,主要是以包涵體的形式存在。Western blotting分析顯示,各目的蛋白均在分子量約19kDa處出現(xiàn)單一條帶。 4.經(jīng)Ni2+-NTA純化系統(tǒng)及尿素透析,各重組蛋白得到了有效純化和復(fù)性。純化蛋白在SDS-PAGE上呈現(xiàn)單一條帶。經(jīng)Sephadex G-75柱層析后得到各重組突變體的同源三聚體分子。 5.生物學(xué)活性分析顯示,所制備的msTALL-2-S、msTALL-2-D和msTALL-2-R三種突變體蛋白均能與A549肺癌細胞及HepG2肝癌細胞上的受體結(jié)合,并且可以不同程度地阻斷sTALL-2功能,抑制其對腫瘤細胞的增殖作用。 重組人可溶性TALL-2突變體的制備及功能研究,為研制新型TALL-2抑制分子創(chuàng)造了條件,同時有助于揭示TALL-2發(fā)揮作用的關(guān)鍵功能位點以及為深入闡明其作用機制提供新的有力證據(jù),進而為TALL-2高表達相關(guān)的多種惡性腫瘤的治療性研究奠定了一定基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R392

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

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本文編號：2320652