【摘要】： 細(xì)胞膜離子通道在許多疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)生基因、蛋白表達(dá)及功能水平上的改變，并引起一系列臨床癥狀，離子通道還是許多疾病的藥物靶點(diǎn)，本論文旨在研究原發(fā)性紅斑肢痛癥和腦缺血這兩種疾病中不同離子通道的變異、調(diào)節(jié)和功能變化在疾病中的作用。 第一部分原發(fā)性紅斑肢痛癥相關(guān)的離子通道功能改變 原發(fā)性紅斑肢痛癥是一種常染色體顯性遺傳病，主要臨床表現(xiàn)為四肢末端反復(fù)發(fā)作的陣發(fā)性對(duì)稱(chēng)性灼痛，熱刺激或運(yùn)動(dòng)后加重，遇冷后可部分緩解，現(xiàn)在尚無(wú)很好的治療藥物。其病因和病生理機(jī)制長(zhǎng)期以來(lái)并不清楚，最近研究發(fā)現(xiàn)電壓依賴(lài)性鈉離子通道Nav1.7突變可導(dǎo)致原發(fā)性紅斑肢痛癥的疼痛等相關(guān)癥狀。本研究中，我們采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)先后研究了在中國(guó)人群中發(fā)現(xiàn)的兩例原發(fā)性紅斑肢痛癥的Nav1.7通道突變L858F和V872G的電生理功能學(xué)變化，并探討了溫度降低緩解原發(fā)性紅斑肢痛癥疼痛的機(jī)理。 一、本研究中的L858F突變的受累者為兩名兒童，其父親為無(wú)癥狀的嵌合體。我們對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染野生型Nav1.7和Nav1.7-L858F突變體的細(xì)胞的鈉通道各項(xiàng)電生理學(xué)參數(shù)進(jìn)行了比較。我們發(fā)現(xiàn)：與野生型相比，L858F突變使得穩(wěn)態(tài)半數(shù)激活電位向超極化方向移動(dòng)約9mV，穩(wěn)態(tài)半數(shù)失活電位向去極化方向移動(dòng)約3mV，L858F突變還使得Nav1.7通道的去活化速度顯著變慢，此外通道的復(fù)活速度在突變后顯著加快，而關(guān)閉態(tài)失活速度則顯著變慢，L858F突變還顯著增大Nav1.7通道的斜坡電流，約為野生型的4倍。這些結(jié)果提示L858F突變使得Nav1.7通道發(fā)生“功能增強(qiáng)”的變化，從而使得表達(dá)Nav1.7的外周感覺(jué)神經(jīng)元電興奮性增強(qiáng)，原發(fā)性紅斑肢痛癥患者表現(xiàn)出相關(guān)的疼痛癥狀。 二、降溫可以部分緩解原發(fā)性紅斑肢痛癥的疼痛癥狀，因此我們?cè)趯?duì)L858F突變體電生理學(xué)功能研究的基礎(chǔ)上，又觀察了溫度變化對(duì)Nav1.7通道野生型和L858F突變體門(mén)控特性的影響。在實(shí)驗(yàn)中我們分別選擇了16℃、25℃和35℃作為參照溫度。研究發(fā)現(xiàn)：對(duì)于Nav1.7野生型通道和L858F突變體，溫度降低都使得通道電流密度降低，去活化速度變慢，以及斜坡電流增大。此外溫度降低后野生型通道的穩(wěn)態(tài)半數(shù)激活電位沒(méi)有發(fā)生顯著性變化，而L858F突變體的穩(wěn)態(tài)半數(shù)激活電位卻向去極化方向移動(dòng)，所以低溫下突變體的激活閾值更接近野生型，這可能是降溫緩解原發(fā)性紅斑肢痛癥疼痛的生理基礎(chǔ)。 三、本研究中V872G突變所累及的患者為一散發(fā)病例，我們對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染該突變體的細(xì)胞株和轉(zhuǎn)染野生型Nav1.7通道的細(xì)胞株電生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)：V872G突變使得Nav1.7通道穩(wěn)態(tài)半數(shù)激活電位向超極化方向移動(dòng)約3mV，穩(wěn)態(tài)半數(shù)失活電位向去極化方向移動(dòng)約7mV，突變后通道的去活化速度變慢，復(fù)活速度加快，而關(guān)閉態(tài)失活速度變慢，此外V872G突變還使得Nav1.7通道的斜坡電流增大至野生型的2.5倍。因此我們認(rèn)為Nav1.7通道的V872G突變也是一種“功能增強(qiáng)”的突變，導(dǎo)致感覺(jué)神經(jīng)元異常放電，患者產(chǎn)生疼痛反應(yīng)。 總之，我們的研究表明在原發(fā)性紅斑肢痛癥中新發(fā)現(xiàn)的Nav1.7通道的L858F和V872G突變都是使得鈉通道發(fā)生“功能增強(qiáng)”的變化，表達(dá)Nav1.7通道的神經(jīng)元電興奮性增強(qiáng)，導(dǎo)致患者表現(xiàn)出相關(guān)的疼痛癥狀。溫度降低后使得突變體和野生型鈉通道激活閾值差異減小，疼痛得以緩解。 第二部分瞬時(shí)受體電位通道亞型在大鼠腦缺血中的基因表達(dá)及藥理學(xué)研究 瞬時(shí)受體電位通道(Transient Receptor Potential Channel，TRP Channel)是一類(lèi)重要的非選擇性陽(yáng)離子通道，因其分布廣泛，參與細(xì)胞眾多基本生理功能，近年來(lái)成為離子通道領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。腦缺血是腦血管疾病中最主要的類(lèi)型，嚴(yán)重危害著人類(lèi)的健康。腦缺血發(fā)生時(shí)以及缺血后再灌注可引起神經(jīng)元缺氧、氧自由基爆發(fā)和酸中毒等眾多病理生理學(xué)變化。以往研究報(bào)道瞬時(shí)受體電位通道TRPM2和TRPM7亞型可被包括缺氧和氧自由基等在內(nèi)的多種因素所調(diào)節(jié)，在神經(jīng)元死亡中起著重要的作用。為此我們應(yīng)用大腦中動(dòng)脈阻斷方法建立大鼠急性短暫性腦缺血模型和持續(xù)性腦缺血模型，采用Real-Time PCR的方法分別檢測(cè)了這兩種病理?yè)p傷過(guò)程中大鼠皮層和海馬不同時(shí)間點(diǎn)的TRPM2和TRPM7通道m(xù)RNA表達(dá)的變化。 對(duì)大鼠大腦皮層的研究發(fā)現(xiàn)：在短暫性腦缺血中，TRPM2 mRNA在缺血2h后再灌24h時(shí)表達(dá)顯著降低，減少了66.3％，TRPM7 mRNA在再灌2h、12h和24h時(shí)表達(dá)都顯著降低，分別減少了47.2％，50.9％和68.9％。；在持續(xù)性腦缺血中，TRPM2 mRNA在缺血2h、12h和24h時(shí)表達(dá)都顯著下降，分別減少了27.5％，55.9％和19.6％，TRPM7 mRNA在缺血2h和24h時(shí)表達(dá)亦顯著下降，分別減少了26.6％和34.4％。對(duì)大鼠大腦海馬的研究發(fā)現(xiàn)，在短暫性腦缺血中TRPM2 mRNA表達(dá)在缺血2h后再灌的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)都沒(méi)有顯著性變化，TRPM7 mRNA在再灌6h時(shí)表達(dá)顯著升高，增加了141.5％；在持續(xù)性腦缺血中TRPM2 mRNA在缺血2h和6h時(shí)表達(dá)顯著升高，分別增加了47.5％和31.3％，TRPM7 mRNA亦在缺血2h和6h時(shí)表達(dá)顯著性升高，分別增加了1188.5％和347.4％。結(jié)果表明無(wú)論TRPM2還是TRPM7在大鼠大腦皮層缺血和海馬缺血的病理過(guò)程中的作用都不相同，特別是TRPM7可能在海馬缺血中起著非常重要的作用。 鑒于TRPM7通道的重要生理功能和病生理作用，我們構(gòu)建了四環(huán)素調(diào)控的穩(wěn)定表達(dá)TRPM7通道的細(xì)胞株。四環(huán)素誘導(dǎo)后TRPM7通道高表達(dá)，并產(chǎn)生TRPM7通道特異性電流，電流的大小對(duì)四環(huán)素劑量和誘導(dǎo)時(shí)間呈現(xiàn)出一定的依賴(lài)性。同時(shí)我們采用激光共聚焦成像技術(shù)觀察了左旋丁基苯酞(1-NBP)，，我們課題組自主研發(fā)的新型抗腦缺血藥物，對(duì)表達(dá)TRPM7通道細(xì)胞的胞內(nèi)鈣離子的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)1-NBP可以降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，提示1-NBP對(duì)TRPM7通道可能具有一定的抑制作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類(lèi)號(hào)】：R363

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本文編號(hào)：2318143