【摘要】：【目的】建立用實時熒光定量RT—PCR法在mRNA水平上檢測腫瘤細(xì)胞中多藥耐藥基因(mdr-1基因)表達(dá)的方法，實現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞中mdr-1 mRNA快速，準(zhǔn)確的檢測，對臨床治療和腫瘤預(yù)后判斷提供輔助手段。 【材料與方法】 1．細(xì)胞培養(yǎng)：用含10％小牛血清的RPML1640培養(yǎng)基對乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞株MCF-7／ADR于孵箱內(nèi)單層連續(xù)傳代培養(yǎng)，用0.25％的胰酶及0.25％的EDTA用直接吹打法傳代。 2．細(xì)胞和組織總RNA提�。河肂iozol試劑分別提取乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞株MCF-7／ADR細(xì)胞和人乳腺癌腫瘤組織中的總RNA。 3．cDNA的合成：以所提取的乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞株MCF-7／ADR及人乳腺癌腫瘤組織所提取的RNA為原料分別進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA。 4．PCR反應(yīng)及重組質(zhì)粒的構(gòu)建：以乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞株MCF-7／ADR逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收法進(jìn)行純化。用PGEM—T Easy質(zhì)粒載體連接PCR純化產(chǎn)物，構(gòu)建重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，，藍(lán)白斑篩選重組質(zhì)粒。 5．熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：優(yōu)化熒光定量PCR體系和條件，并以重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品建立檢測mdr-1 mRNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 6．用所建立的熒光定量PCR方法對58例乳腺癌標(biāo)本中mdr-1 mRNA的含量進(jìn)行測定，同時用免疫組化的方法檢測標(biāo)本中P-gP的表達(dá)，兩種方法進(jìn)行比較，采用X~2檢驗對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。 【結(jié)果】構(gòu)建了mdr-1基因的重組質(zhì)粒，并且成功轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選提取重組質(zhì)粒，對質(zhì)粒進(jìn)行梯度稀釋，以稀釋的質(zhì)粒為模板優(yōu)化熒光定量PCR體系和條件，建立最佳熒光定量PCR體系，
[Abstract]:[objective] to establish a real-time fluorescent quantitative RT-PCR method for the detection of multidrug resistance gene (mdr-1 gene) in tumor cells at mRNA level, and to detect mdr-1 mRNA in tumor cells quickly and accurately. To provide the auxiliary means for clinical treatment and prognosis judgment of tumor. [materials and methods] 1. Cell culture: using RPML1640 medium containing 10% calf serum, the MCF-7/ADR cell line of breast cancer resistant to doxorubicin was cultured continuously in the incubator. 0.25% trypsin and 0.25% EDTA were subcultured by direct blowing. 2. Total RNA extraction from cells and tissues: total RNA. was extracted from MCF-7/ADR cells and human breast cancer tumor tissues by Biozol reagent, respectively. Synthesis of 3.cDNA: cDNA. was obtained by reverse transcription reaction of MCF-7/ADR, a breast cancer cell line resistant to doxorubicin, and RNA extracted from human breast cancer tissue, respectively. 4.PCR reaction and construction of recombinant plasmid: using MCF-7/ADR reverse transcription cDNA of breast cancer adriamycin resistant cell line as template, general PCR amplification was carried out. The amplified PCR products were purified by agarose gel recovery method. The recombinant plasmid was constructed by ligating the purified PCR product with PGEM-T Easy plasmid vector. The recombinant plasmid was transformed into E. coli JM109 competent cells, and the recombinant plasmid was screened by blue and white spot. 5. Establishment of standard curve of fluorescence quantitative PCR: optimize the system and condition of fluorescent quantitative PCR, and establish standard curve of mdr-1 mRNA with recombinant plasmid as standard. 6. The content of mdr-1 mRNA in 58 cases of breast cancer was determined by fluorescence quantitative PCR method, and the expression of P-gP in 58 cases of breast cancer was detected by immunohistochemical method. The data were analyzed statistically by X2 test. [results] Recombinant plasmid of mdr-1 gene was constructed and transformed into E. coli JM109 receptive cells successfully. The recombinant plasmid was extracted by blue and white spot screening, and the plasmid was diluted by gradient dilution. The system and conditions of fluorescent quantitative PCR were optimized by using diluted plasmid as template, and the optimal fluorescent quantitative PCR system was established.
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R346

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 曾愛華 ,何蘊韶 ,李虎,王穗海;實時熒光定量PCR檢測乳腺癌5種多藥耐藥基因的表達(dá)強度[J];陜西醫(yī)學(xué)雜志;2005年02期

2 徐光輝,葉勝龍,鄭義同,張為民,吉亞君;人乳腺癌中3種耐藥基因產(chǎn)物的表達(dá)及其與預(yù)后的相關(guān)性[J];復(fù)旦學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2005年01期

3 程燕紅;齊靜;熊冬生;劉杰文;齊淑玲;潘兵;楊純正;朱惠芳;;鈣調(diào)素拮抗劑O-(4-乙氧基)-丁基-小檗胺對乳腺癌多藥耐藥細(xì)胞系MCF-7/ADR的耐藥逆轉(zhuǎn)作用[J];中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報;2006年02期

4 任新敏;;乳腺癌健康宣教[J];中外婦兒健康;2011年06期

5 魯子成;;早期乳腺癌保乳手術(shù)的治療分析[J];北方藥學(xué);2011年10期

6 ;橄欖油做菜可預(yù)防乳腺癌[J];保健醫(yī)苑;2011年11期

7 張銀芳;;60例乳腺癌病人的治療方案及健康教育[J];全科護(hù)理;2011年31期

8 ;為何乳腺疾病總是鐘情“剩女”[J];幸福(婚姻);2011年10期

9 王健;于來祥;;乳腺癌雌孕激素受體狀態(tài)與Her-2/neu相關(guān)性的研究[J];中國冶金工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志;2011年05期

10 張克勤;;舉辦全國液晶熱圖診斷乳腺癌講習(xí)班[J];中國腫瘤臨床;1983年03期

相關(guān)會議論文 前10條

1 侯曉薇;;乳腺癌的基因診斷[A];第七屆全國中西醫(yī)結(jié)合普通外科臨床及基礎(chǔ)研究學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2001年

2 姬香魁;劉世剛;董守義;張杏茹;;364例乳腺癌X線診斷分析[A];第一屆全國中西醫(yī)結(jié)合乳腺疾病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2002年

3 王曉亞;劉會英;;乳腺癌病人的心理分析及護(hù)理措施[A];全國重癥監(jiān)護(hù)護(hù)理學(xué)術(shù)交流暨專題講座會議論文匯編[C];2004年

4 許紅強;;不典型乳腺纖維腺瘤的彩超診斷及其與乳腺癌的鑒別診斷[A];中華醫(yī)學(xué)會第十次全國超聲醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2009年

5 魏慧娟;羅賢懋;楊湘平;;鉬和鎢對SD大鼠乳腺癌的影響[A];中國營養(yǎng)學(xué)會首屆微量元素專題討論會論文摘要匯編[C];1985年

6 朱雄增;曾郁;楊文濤;朱雄增;;實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測乳腺癌中HOXA5 mRNA表達(dá)[A];中華醫(yī)學(xué)會病理學(xué)分會2005年學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2005年

7 錢明山;;乳腺癌的X線診斷與鑒別診斷[A];第八次全國中西醫(yī)結(jié)合影像學(xué)術(shù)交流大會暨全國中西醫(yī)結(jié)合影像學(xué)研究進(jìn)展學(xué)習(xí)班論文集[C];2005年

8 陳萍;;小議乳腺癌顯示的最佳攝影位置及質(zhì)量控制[A];中華醫(yī)學(xué)會第十三屆全國放射學(xué)大會論文匯編（下冊）[C];2006年

9 柳莉莎;冷曉玲;馬富成;;高頻超聲和X線鉬靶在乳腺癌診斷中的臨床研究[A];第二屆全國乳腺影像診斷與技術(shù)應(yīng)用研討會暨學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2007年

10 楊衛(wèi)軍;吳正陽;李春來;黃志剛;尹家俊;張錦瑜;;76例Ⅰ、Ⅱ期乳腺癌前哨淋巴結(jié)研究[A];2007年貴州省醫(yī)學(xué)會外科分會學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2007年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 錢錚;日發(fā)現(xiàn)抑制乳腺癌發(fā)展的新途徑[N];中國醫(yī)藥報;2006年

2 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院307醫(yī)院乳癌科 王濤 江澤飛;2009NCCN乳腺癌治療指南解讀[N];健康報;2009年

3 歐旭江;乳腺癌，女性疾病第一防[N];浙江日報;2004年

4 程守勤;40～60歲婦女易患乳腺癌[N];健康報;2006年

5 副主任醫(yī)師 吳春;乳腺癌會遺傳嗎[N];衛(wèi)生與生活報;2006年

6 張忠霞;唾液分析法可及早診斷乳腺癌[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報;2007年

7 范杉珊;我區(qū)乳腺癌研究取得突破性進(jìn)展[N];華興時報;2008年

8 劉涓;乳腺癌：女性健康“第一殺手”[N];大眾衛(wèi)生報;2008年

9 受訪專家:廣東省人民醫(yī)院腫瘤中心乳腺科副主任醫(yī)師 廖寧博士 采寫:本報記者 郭靜 通訊員 張玲玲;更年期女性要定期篩查乳腺癌[N];廣東科技報;2009年

10 海濤;癌癥與女性生育[N];醫(yī)藥養(yǎng)生保健報;2009年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 何山;乳腺癌新術(shù)式及前哨淋巴結(jié)檢測的臨床研究[D];蘇州大學(xué);2005年

2 施俊義;部分耐藥基因和蛋白在乳腺癌病例中的表達(dá)[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2002年

3 張子豹;人工流產(chǎn)與乳腺癌關(guān)系的病例對照研究[D];復(fù)旦大學(xué);2003年

4 孫濤;多西紫杉醇對人乳腺（癌）細(xì)胞增殖、侵襲力及鉀離子通道特性的影響[D];中國醫(yī)科大學(xué);2005年

5 郭會芹;乳腺腫瘤細(xì)胞中心體研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2006年

6 鮑慧錚;血清p53抗體檢測在乳腺癌患者新輔助化療中的臨床應(yīng)用研究[D];東北師范大學(xué);2008年

7 黃家君;EGFR介導(dǎo)的c-erbB2反義顯像診斷乳腺癌的實驗研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2002年

8 趙美蓉;抑癌基因產(chǎn)物Rb蛋白在乳腺癌中的表達(dá)及其意義[D];吉林大學(xué);2006年

9 徐迎春;乳腺癌疾病特征分布和內(nèi)分泌治療藥物基因組學(xué)研究[D];吉林大學(xué);2006年

10 韓定芬;乳腺癌流行病學(xué)及雌激素代謝酶相關(guān)基因的研究[D];武漢大學(xué);2004年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 徐曉妹;多藥耐藥基因MDR1及P-gp、C-erbB-2蛋白在乳腺癌中的表達(dá)及臨床意義[D];青島大學(xué);2002年

2 徐中林;乳腺癌HIFU治療后局部APC及活化分子的表達(dá)[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2002年

3 何本夫;組織多肽特異性抗原在乳腺癌、肺癌和胃腸道腫瘤中的臨床研究[D];中國人民解放軍第一軍醫(yī)大學(xué);2003年

4 柯紅;乳腺癌局部皮溫變化和微血管密度的相關(guān)性研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2004年

5 鄭雅娟;彩色多普勒超聲和遠(yuǎn)紅外熱圖對乳腺癌診斷價值的評價[D];浙江大學(xué);2005年

6 吳雪花;PTEN，Cathepsin D與乳腺癌長期預(yù)后關(guān)系的研究[D];浙江大學(xué);2005年

7 曹偉紅;新輔助化療對乳腺癌細(xì)胞周期及超微結(jié)構(gòu)的影響[D];青島大學(xué);2005年

8 張玉松;腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體對乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡影響的實驗研究[D];蘇州大學(xué);2005年

9 朱偉良;乳腺癌新輔助化療后前哨淋巴結(jié)活檢的研究[D];蘇州大學(xué);2008年

10 蘇清秀;短雙歧桿菌作為靶向載體在乳腺癌的基因治療中的實驗研究[D];吉林大學(xué);2010年

本文編號：2317552