【摘要】：【目的】建立用實(shí)時(shí)熒光定量RT—PCR法在mRNA水平上檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中多藥耐藥基因(mdr-1基因)表達(dá)的方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞中mdr-1 mRNA快速，準(zhǔn)確的檢測(cè)，對(duì)臨床治療和腫瘤預(yù)后判斷提供輔助手段。 【材料與方法】 1．細(xì)胞培養(yǎng)：用含10％小牛血清的RPML1640培養(yǎng)基對(duì)乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞株MCF-7／ADR于孵箱內(nèi)單層連續(xù)傳代培養(yǎng)，用0.25％的胰酶及0.25％的EDTA用直接吹打法傳代。 2．細(xì)胞和組織總RNA提�。河肂iozol試劑分別提取乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞株MCF-7／ADR細(xì)胞和人乳腺癌腫瘤組織中的總RNA。 3．cDNA的合成：以所提取的乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞株MCF-7／ADR及人乳腺癌腫瘤組織所提取的RNA為原料分別進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA。 4．PCR反應(yīng)及重組質(zhì)粒的構(gòu)建：以乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞株MCF-7／ADR逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收法進(jìn)行純化。用PGEM—T Easy質(zhì)粒載體連接PCR純化產(chǎn)物，構(gòu)建重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，，藍(lán)白斑篩選重組質(zhì)粒。 5．熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：優(yōu)化熒光定量PCR體系和條件，并以重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品建立檢測(cè)mdr-1 mRNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 6．用所建立的熒光定量PCR方法對(duì)58例乳腺癌標(biāo)本中mdr-1 mRNA的含量進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)用免疫組化的方法檢測(cè)標(biāo)本中P-gP的表達(dá)，兩種方法進(jìn)行比較，采用X~2檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 【結(jié)果】構(gòu)建了mdr-1基因的重組質(zhì)粒，并且成功轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選提取重組質(zhì)粒，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行梯度稀釋，以稀釋的質(zhì)粒為模板優(yōu)化熒光定量PCR體系和條件，建立最佳熒光定量PCR體系，
[Abstract]:[objective] to establish a real-time fluorescent quantitative RT-PCR method for the detection of multidrug resistance gene (mdr-1 gene) in tumor cells at mRNA level, and to detect mdr-1 mRNA in tumor cells quickly and accurately. To provide the auxiliary means for clinical treatment and prognosis judgment of tumor. [materials and methods] 1. Cell culture: using RPML1640 medium containing 10% calf serum, the MCF-7/ADR cell line of breast cancer resistant to doxorubicin was cultured continuously in the incubator. 0.25% trypsin and 0.25% EDTA were subcultured by direct blowing. 2. Total RNA extraction from cells and tissues: total RNA. was extracted from MCF-7/ADR cells and human breast cancer tumor tissues by Biozol reagent, respectively. Synthesis of 3.cDNA: cDNA. was obtained by reverse transcription reaction of MCF-7/ADR, a breast cancer cell line resistant to doxorubicin, and RNA extracted from human breast cancer tissue, respectively. 4.PCR reaction and construction of recombinant plasmid: using MCF-7/ADR reverse transcription cDNA of breast cancer adriamycin resistant cell line as template, general PCR amplification was carried out. The amplified PCR products were purified by agarose gel recovery method. The recombinant plasmid was constructed by ligating the purified PCR product with PGEM-T Easy plasmid vector. The recombinant plasmid was transformed into E. coli JM109 competent cells, and the recombinant plasmid was screened by blue and white spot. 5. Establishment of standard curve of fluorescence quantitative PCR: optimize the system and condition of fluorescent quantitative PCR, and establish standard curve of mdr-1 mRNA with recombinant plasmid as standard. 6. The content of mdr-1 mRNA in 58 cases of breast cancer was determined by fluorescence quantitative PCR method, and the expression of P-gP in 58 cases of breast cancer was detected by immunohistochemical method. The data were analyzed statistically by X2 test. [results] Recombinant plasmid of mdr-1 gene was constructed and transformed into E. coli JM109 receptive cells successfully. The recombinant plasmid was extracted by blue and white spot screening, and the plasmid was diluted by gradient dilution. The system and conditions of fluorescent quantitative PCR were optimized by using diluted plasmid as template, and the optimal fluorescent quantitative PCR system was established.
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R346

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本文編號(hào)：2317552