【摘要】： 蚊媒傳播的瘧疾是一種嚴重危害人類健康的熱帶傳染病,在全世界人群中具有很高的發(fā)病率和致死率,影響流行地區(qū)經(jīng)濟和社會發(fā)展,威脅著100多個國家近40%的世界人口,在熱帶和亞熱帶地區(qū)尤為嚴重。雖然經(jīng)過瘧疾工作者長期不懈的努力探索,但是目前全世界每年大約有3～5億人感染,約1～3百萬患者因瘧疾感染而死亡,其中絕大多數(shù)是五歲以下的兒童。在我國南方地區(qū),尤其是山區(qū),在特定的環(huán)境下仍有大規(guī)模流行的可能。近年來,隨著瘧原蟲多藥抗性株的出現(xiàn)與迅速擴散以及蚊媒對殺蟲劑耐受性的增加,而目前又無有效的抗瘧疫苗,這給瘧疾防治工作帶來很大的困難。瘧疾控制工作正面臨巨大的挑戰(zhàn),尋求新型、高效、安全的瘧疾控制策略已迫在眉睫。 瘧疾由感染性蚊媒叮咬傳播,瘧原蟲子孢子進入血循環(huán)后可迅速粘附并侵入肝細胞,完成紅外期增殖之后才侵入紅細胞導(dǎo)致瘧疾發(fā)作。所以干擾裂殖子在肝細胞內(nèi)的發(fā)育是防止瘧疾傳播與臨床癥狀出現(xiàn)的關(guān)鍵。因此研制靶向紅外期瘧原蟲的疫苗不僅可防止紅內(nèi)期瘧原蟲導(dǎo)致的病理損傷,還可阻斷配子體傳播。然而宿主肝細胞、肝組織所產(chǎn)生的高背景干擾,以及難以獲得足量高純度肝期瘧原蟲的技術(shù)障礙嚴重阻礙了瘧原蟲紅外期的研究。但隨著分子生物學(xué)和生物化學(xué)技術(shù)的發(fā)展,瘧原蟲紅外期方面的研究已經(jīng)越來越受到人們關(guān)注。 瘧原蟲抗原差異與變異十分普遍,并具有非常復(fù)雜的抗原結(jié)構(gòu)和眾多不同的抗原表位,多數(shù)抗原表位在生活史不同時期具有階段特異性,此外瘧原蟲還存在種、株特異性及抗原性弱等特點,侵入宿主體后可引起復(fù)雜的免疫反應(yīng)。T細胞免疫在瘧原蟲引起的免疫應(yīng)答中具有至關(guān)重要的地位,因此,研究誘導(dǎo)T細胞活化的共刺激分子在紅外期免疫中的作用是瘧疾治療及疫苗研制的基礎(chǔ)。 因此本課題以分離獲得的約氏瘧原蟲子孢子經(jīng)尾靜脈注射感染大鼠,建立約氏瘧原蟲—斯氏按蚊—哺乳動物宿主模型,對紅外期瘧原蟲在宿主體內(nèi)發(fā)育變化以及宿主免疫系統(tǒng)接受瘧原蟲刺激后所產(chǎn)生免疫應(yīng)答的兩個方面進行研究:一方面應(yīng)用差異顯示PCR(differential display PCR,DD-PCR)技術(shù)篩選約氏瘧原蟲紅外期cDNA,經(jīng)比較分析獲得的差異序列,克隆至TA載體,根據(jù)序列同源分析和功能預(yù)測結(jié)果,推測可能與瘧原蟲紅外期發(fā)育相關(guān)的基因;另一方面采用RT-PCR與直接免疫熒光反應(yīng)、激光共聚焦技術(shù)相結(jié)合的方法,從基因和共刺激分子表達情況對宿主針對瘧原蟲抗原刺激產(chǎn)生的免疫反應(yīng)進行研究。實驗內(nèi)容和結(jié)果主要包括以下幾個方面: 1.針對瘧原蟲基因A+T含量高(＞70%)的特點,本實驗通過改變常規(guī)DD-PCR引物的A+T含量,設(shè)計能從肝組織和瘧原蟲混存樣本中特異擴增瘧原蟲基因的A+T含量60%的引物,與DD-PCR技術(shù)相結(jié)合,繞過了純化裂殖子的技術(shù)屏障,特異擴增瘧原蟲基因。將得到的核酸序列登陸GenBank數(shù)據(jù)庫,通過Blast查詢,并進行序列同源性比對、分析,結(jié)果顯示在21個待測克隆中:有8個與約氏瘧原蟲紅外期相關(guān)基因(PyHs4、PyHs5、PyHs6、PyHs7、PyHs8、PyHs9、PyHs10、PyHs11);其中PyHs4與約氏瘧原蟲乙酰葡萄糖胺磷酸變位酶(Phosphoacetylglucosamine mutase,AGM)具有相似性,PyHs5與約氏瘧原蟲紅細胞膜蛋白3(Erythrocyte membrance prontein,EMP3)具有同源性,PyHs6、PyHs7、PyHs8、PyHs9、PyHs10、PyHs11為功能未知基因。發(fā)現(xiàn)、鑒定的瘧原蟲差異基因,為進一步研究瘧原蟲紅外期生長發(fā)育的分子機制提供了理論基礎(chǔ)。 2.采用RT-PCR方法對不同時相點宿主免疫相關(guān)基因B7.1、B7.2、TGF-β、IFN-γ進行定性、定量分析,探討感染瘧原蟲后哺乳動物宿主體內(nèi)免疫相關(guān)基因變化情況:在宿主體感染約氏瘧原蟲后2～72h,B7.1表達幾乎沒有變化;B7.2、TGF-β、IFN-γ轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)(P＜0.05)。該結(jié)果顯示瘧原蟲侵入可能引發(fā)哺乳動物機體免疫防御、免疫調(diào)控等一系列相關(guān)反應(yīng)。將直接免疫熒光反應(yīng)和激光共聚焦技術(shù)相結(jié)合,觀察瘧原蟲感染后共刺激分子B7.1、B7.2的表達定位情況,實驗發(fā)現(xiàn):在所選擇的時相區(qū)間內(nèi),B7.1、B7.2分子表達有升高趨勢,其中B7.1分子上升速度較緩慢在72h后開始下降,而B7.2分子上調(diào)迅速在48h達到峰值后于72h出現(xiàn)回落;在瘧原蟲感染后的2～72h,B7.2的表達水平始終高于B7.1(P＜0.05)。此外,激光掃描共聚焦顯微鏡觀察顯示:瘧原蟲感染后,B7.1、B7.2分子在巨噬細胞的表達隨著時間點推延從細胞漿、細胞核逐漸轉(zhuǎn)移到細胞膜。根據(jù)該現(xiàn)象我們可以推測:接受瘧原蟲刺激后,共刺激分子開始活化,其合成、表達增加并可能與T細胞活化有關(guān)。 綜上所述,我們從寄生蟲和宿主兩方面對紅外期瘧原蟲發(fā)育相關(guān)分子及宿主抗瘧原蟲感染的部分免疫分子進行了研究,較為系統(tǒng)地探討瘧原蟲裂殖子在肝細胞內(nèi)發(fā)育的分子機理以及所引起的免疫反應(yīng),并在基因和免疫分子表達水平初步探討瘧原蟲感染后宿主免疫細胞、效應(yīng)分子的作用機制,從而為新型抗瘧藥物和疫苗研制提供靶目標。
[Abstract]:Anopheles mosquito-borne malaria is a tropical infectious disease that seriously endangers human health. It has high morbidity and mortality in people around the world, affecting economic and social development in epidemic areas, threatening nearly 40% of the world's population in more than 100 countries, Especially in tropical and sub-tropical areas. Despite the long-term efforts of malaria workers to explore, there are currently about 3-500 million people worldwide, about 1-3 million people die due to malaria infection, most of whom are children under five years of age. In the southern region of our country, especially in mountainous areas, there is still a large-scale epidemic in a particular environment. In recent years, with the emergence and rapid diffusion of P-P resistant strains and the increase of mosquito-mediated resistance to insecticides, there is no effective antimalarial vaccine, which brings great difficulties to the prevention and treatment of malaria. Malaria control is facing enormous challenges and seeks new, efficient and safe malaria control strategies. Malaria is transmitted by infectious mosquito bites. After the sporozoites of Plasmodium vivax enter the blood circulation, they can quickly adhere to and invade the liver cells. After the proliferation of the infrared period, the invasion of red blood cells leads to malaria. The development of interfering merozoites in hepatocytes is the prevention of malaria transmission and clinical symptoms. Therefore, the development of vaccine targeting Plasmodium vivax can not only prevent the pathological damage caused by Plasmodium vivax, but also block the gamete. However, the high background interference caused by the host hepatocytes, liver tissue, However, with the development of molecular biology and biochemical technology, the research on the infrared period of P. P. has become more and more affected The antigenic difference and variation of P. falciparum are very common, and have very complex antigenic structure and many different antigen table positions. Most of the antigen table bits have stage specificity in different periods, and there are also species and strains of P. falciparum. has the characteristics of weak antigenicity and the like, and can be caused by invading the host body. Complex immune response. T-cell immunity plays an important role in the immune response caused by P. falciparum. Therefore, the role of co-stimulatory molecules inducing T-cell activation in infrared immunity is malaria therapy. On the basis of the development of vaccine, this topic was used to isolate the sporozoites of Plasmodium yoelii from the tail vein to infect the rats. According to the mammalian host model of Anopheles sinensis, two aspects of the immune response produced by Plasmodium vivax in the host body and the host immune system following the stimulation of Plasmodium vivax were studied: On the one hand, the technique of differential display PCR (DD-PCR) was applied to screen. The cDNA of Plasmodium vivax IR was cloned to TA vector by comparative analysis. According to the result of sequence homology analysis and function prediction, the gene related to the development of Plasmodium vivax was estimated. On the other hand, RT-PCR was used to react with direct immunofluorescence. Method of co-focusing technique, from gene and co-stimulatory molecule expression to host to Plasmodium vivax stimulation The immune response produced was studied. The experimental content and the knot The fruit mainly comprises the following aspects: 1. Aiming at the characteristics of high content of A + T (> 70%) of Plasmodium gene A + T, this experiment has been changed. According to the A + T content of the DD-PCR primer, a primer capable of specifically amplifying the A + T content of the Plasmodium gene from the sample of liver tissue and Plasmodium vivax is designed, the primer is combined with the DD-PCR technology, and the purified merozoite is bypassed. According to the technical barrier, the Plasmodium falciparum gene is specifically amplified. The obtained nucleic acid sequence is accessed into the GenBank database, and the sequence homology comparison is carried out through the Blast query, and the results are shown in 21 clones to be tested: 8 genes related to the infrared period of Plasmodium yoelii (PyHs7, PyHs5, PyHs6, PyHs7, PyHs8, PyHs9 PyHs10, PyHs11), in which PyHs5 is similar to Plasmodium vivax glucosamine phosphate utase (AGM), PyHs5 has homology with Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 3 (EMP3), PyHs6, PyHs7, PyHs8, PyHs9, PyHs1 0. PyHs11 is a functionally unknown gene. The molecular mechanism of long development provides a theoretical foundation. By using the RT-PCR method, we can qualitatively and quantitatively analyze the host immune-related genes B7.1, B7.2, CD28-7721, IFN-, and explore the change of immune-related genes in mammalian hosts after Plasmodium infection. Conditions: There was little change in expression of B7.1 in the host body after infection of Plasmodium yoelii. The transcription level of P <0.05 was significantly increased (P <0.05). By combining direct immunofluorescence and laser co-focusing, the expression and localization of B7. 1 and B7.2 of the co-stimulatory molecules after Plasmodium infection were observed. The molecular expression of B7.1 and B7.2 was increased, in which the rising rate of B7.1 molecules began to decrease after 72h, while the up-regulation of B7.2 molecule increased rapidly after 48h reached the peak value, and then fell back at 72h; in the 2-72h after plasvax infection, the table of B7.2 In addition, laser scanning confocal microscopy showed that after Plasmodium infection, the expression of B7.1, B7.2 molecules in macrophages increased with time. The point is delayed from the cytoplasm and the nucleus gradually transferred to the cell membrane. According to this phenomenon, we can speculate that after the stimulation of P. P., the co-stimulatory molecule begins to activate. In conclusion, we studied some immune molecules of Plasmodium vivax development-related molecule and host anti-malaria parasite from parasites and hosts, and systematically discussed the merozoite of Plasmodium vivax. Molecular mechanism of sub-cell development and immune response induced by Plasmodium vivax, and preliminary study on the host immune cells and effector molecules after Plasmodium infection in the expression level of genes and immune molecules
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R392

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本文編號：2273612