發(fā)布時間：2018-10-10 11:03

【摘要】： 百日咳是一種由百日咳桿菌傳播，侵襲呼吸道并引發(fā)急性呼吸道感染的傳染病，每年導(dǎo)致35萬兒童死亡，感染百日咳的病例數(shù)超過4000萬，主要都集中在發(fā)展中國家。百日咳疫苗是預(yù)防百日咳流行和爆發(fā)的最有力的手段。自20世紀(jì)50年代百日咳全細(xì)胞疫苗即菌體疫苗應(yīng)用以來，已經(jīng)極大地降低了百日咳的發(fā)病率和死亡率。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，實施百日咳菌體疫苗接種已減少了8561。1萬個病例與72.6萬例兒童死亡。但是由于接種產(chǎn)生的嚴(yán)重副反應(yīng)，近年來，百日咳全細(xì)胞疫苗正逐漸被第二代百日咳疫苗即無細(xì)胞疫苗取代。一直到現(xiàn)在，即使百日咳疫苗已經(jīng)普遍推廣，百日咳仍然是公共健康衛(wèi)生的一個重大威脅，百日咳發(fā)病率一直在顯著提高�？赡艿脑虬ǎ�1．目前使用的百日咳全細(xì)胞疫苗和無細(xì)胞疫苗都不能對兒童產(chǎn)生終生免疫，一般3—5年后保護(hù)力就逐漸消失；2．副百日咳桿菌也能引起百日咳，不過癥狀要比百日咳桿菌引起的要輕，而且病癥耐受期也要短。當(dāng)前使用的百日咳疫苗對越來越來多的副百日咳感染者沒有保護(hù)力或保護(hù)力不足。因此需要進(jìn)一步提高現(xiàn)有百日咳疫苗的保護(hù)效力。由于人是百日咳桿菌的唯一宿主，缺乏合適的動物研究模型，百日咳桿菌的致病機(jī)理以及導(dǎo)致宿主產(chǎn)生的免疫機(jī)制一直還不是完全清楚，極大地限制了發(fā)展百日咳新疫苗。當(dāng)前對百日咳疫苗的研究主要是融合表達(dá)多抗原或DNA疫苗等基因工程疫苗，但這些新疫苗的免疫效果都不令人滿意。除了疫苗預(yù)防外，藥物的預(yù)防和治療也是控制百日咳流行的必不可少的手段。到目前為止，百日咳治療常用的抗生素(主要是大環(huán)內(nèi)酯類抗生素)都或多或少產(chǎn)生一些嚴(yán)重的副作用，尤其對嬰幼兒，而且沒有一個大環(huán)內(nèi)酯類抗生素被美國FDA批準(zhǔn)應(yīng)用到6個月以下的嬰兒身上。因此，現(xiàn)在急需找到針對百日咳桿菌和副百日咳桿菌的疫苗候選抗原和藥物靶點(diǎn)。 免疫蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，，融合了抗體識別的特異性和高分辨率能力的2D雙向電泳和精確的質(zhì)譜分析，廣泛應(yīng)用于篩選疫苗抗原、診斷抗原、新型藥物和臨床標(biāo)志物等研究。在本研究中，免疫蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)被首次應(yīng)用鑒定百日咳桿菌的免疫原性蛋白。百日咳桿菌的膜蛋白和胞外分泌蛋白分別用經(jīng)典的TritonX-114和TCA—丙酮沉淀法制備。免疫印跡使用免疫百日咳全細(xì)胞疫苗的兒童血清。MADLI-TOF／MS質(zhì)譜—共鑒定出了32個免疫原性蛋白，包括27個膜蛋白和11個胞外蛋白。在這些免疫原性蛋白中，69KDa蛋白或粘附素、血清抗性蛋白和外膜孔蛋白是已知的百日咳桿菌重要的毒力因子，其中粘附素還是百日咳無細(xì)胞疫苗的重要成分之一；血清抗性蛋白也是百日咳桿菌抵抗宿主機(jī)體內(nèi)補(bǔ)體殺傷作用的決定因素。而編碼外膜配體結(jié)合蛋白的基因是唯一一個被鑒定出的是Bvg—中間相的基因，Bvg—中間相被認(rèn)為是百日咳桿菌從體外傳播進(jìn)入到人體內(nèi)起始粘附過程的一個重要的中間環(huán)節(jié)。蛋白合成延伸因子Tu／Ts、3-磷酸甘油醛和分子伴侶蛋白GroEL是在許多病原微生物免疫蛋白質(zhì)組學(xué)研究中都被鑒定出具有強(qiáng)免疫原性的標(biāo)志性蛋白，在本研究中，也被鑒定出來了。乳酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶、乙醇脫氫酶、谷氨酸脫氫酶、異丙基異構(gòu)酶、青霉素結(jié)合蛋白和ATP結(jié)合蛋白雖然是首次在百日咳桿菌中被證實具有免疫原性，但是這些免疫原性蛋白已經(jīng)在其他一個或多個病原微生物的免疫蛋白質(zhì)組學(xué)研究中被鑒定出來了。其他被發(fā)現(xiàn)具有免疫原性的蛋白還包括硫酸鹽結(jié)合蛋白、2-羥基酸脫氫酶、氨基酸周質(zhì)結(jié)合蛋白和假定蛋白BP3575和BP2818等，尤其是假定蛋白BP3575和BP2818，雖然功能未知，但是卻具有良好的免疫原性，更值得深入去研究。通過對這些免疫原性蛋白的深入研究有助于更好地了解百日咳桿菌的致病機(jī)制以及與宿主的相互作用。為研究新的百日咳疫苗提供一定的理論基礎(chǔ)。 除了免疫蛋白質(zhì)組學(xué)研究外，本研究還整合了生物信息學(xué)分析、比較基因組雜交數(shù)據(jù)、基因表達(dá)譜和蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)來篩選針對百日咳桿菌和副百日咳桿菌的疫苗候選抗原和藥物靶點(diǎn)。在百日咳桿菌3436個ORFs中，總共731個基因，包括671個在百日咳桿菌GMT-1菌株和副百日咳桿菌12822菌株都高度表達(dá)基因和81個百日咳桿菌GMT-1菌株的37℃表達(dá)上調(diào)基因，這37℃表達(dá)上調(diào)基因同時也存在于副百日咳桿菌基因組，這731個基因被篩選出來作為初步的候選抗原。在去掉胞質(zhì)蛋白、跨膜結(jié)構(gòu)超過4的內(nèi)膜蛋白、在137株百日咳桿菌和28株副百日咳桿菌中不保守的蛋白以及與宿主高度同源的蛋白后，最后191個抗原被篩選出來作為針對百日咳桿菌和副百日咳桿菌的候選抗原。這191個候選抗原或者具有高度轉(zhuǎn)錄水平，或者和細(xì)菌毒力與致病性高度相關(guān)，而且這些抗原不僅暴露于細(xì)菌表面，還在165株百日咳桿菌和副百日咳桿菌中高度保守，在宿主體內(nèi)沒有高度同源蛋白，不會產(chǎn)生交叉反應(yīng)，損害宿主。在百日咳桿菌和副百日咳桿菌的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中，從191個候選抗原進(jìn)一步鑒定出22個高度連接蛋白，這22個蛋白都參與細(xì)菌能量或物質(zhì)代謝等重要過程，為百日咳桿菌和副百日咳桿菌維持基本的生命活動所必需，能作為合適的百日咳治療藥物靶點(diǎn)。對這191個疫苗候選抗原包括22個潛在的藥物靶點(diǎn)的研究能加速發(fā)展更有效的百日咳新疫苗和藥物。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R378

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本文編號：2261525