【摘要】： 鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一受Ca~(2+)／鈣調(diào)素(CaM)調(diào)節(jié)的絲氨酸／蘇氨酸的蛋白磷酸酶，它廣泛分布在腦、心肌、骨骼肌、T淋巴細胞等組織細胞中，通過對底物去磷酸化參與細胞功能的調(diào)節(jié)。CaN可由Ca~(2+)介導(dǎo)的外部信號及細胞內(nèi)的氧化還原電位共同調(diào)節(jié)。為了進一步研究CaN的作用，我們擬在不同組織中、氧化還原和腦缺血及預(yù)處理情況下，觀察CaN的活性變化特點，并對其原因作進一步探究。 研究目的 第一部分： 測定不同組織中CaN活性及其鈣依賴性，觀察不同組織中CaN的分布和鈣依賴性特點。 第二部分： 觀察腦缺血及腦缺血預(yù)處理動物的腦梗死體積變化和CaN活性變化，來評價缺血預(yù)處理對缺血腦組織的保護作用。 第三部分： 觀察氧化和抗氧化作用對CaN活性的影響，以了解缺血和缺血預(yù)處理在氧化還原方面保護CaN活性的可能機制。 實驗方法 第一部分： 提取不同組織的CaN，測定蛋白濃度，應(yīng)用紫外分光光度法測定CaN活性；配置濃度不同的CaCl_2溶液，加入反應(yīng)體系使其CaCl_2總濃度為0.25，0.50，0.75，1.00，1.25，1.50，1.75，2.00mM，測定CaN活性。 第二部分： 1大鼠用水合氯醛腹腔麻醉固定后，應(yīng)用Pulsinelli四血管阻斷法制備大鼠全腦缺血和預(yù)缺血模型。 2TTC方法染色，觀察BRI的情況。 3提取CaN，測定蛋白濃度，根據(jù)CaN測定反應(yīng)體系的要求，加入相應(yīng)的反應(yīng)物和離子，應(yīng)用紫外分光光度法測定CaN活性，反應(yīng)溫度為30℃，檢測波長為405nm，檢測間隔為30s，時間為5min。 第三部分： 取大鼠骨骼肌組織，提取CaN組織液，分六組(n＝15)做不同氧化和抗氧化處理，空白組不加任何處理，對照組加黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶，其余四組：除加入同等劑量黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶外，各組分別加入超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、甘露醇、二硫蘇糖醇(DTT)，提取骨骼肌CaN，測定蛋白濃度，向各組加入相應(yīng)的處理因素，應(yīng)用紫外分光光度法測定CaN活性，觀察變化。 實驗結(jié)果 第一部分： 1不同組織CaN活性比較 應(yīng)用紫外分光光度法測定CaN活力(nmol／min／mg protein)，結(jié)果為腦組織活力為6.81±2.41，與其它組比較活力最高(P＜0.01)，其次為骨骼肌組織2.08±1.65，心肌組織為1.75±0.76，肝臟組織最低0.38±0.20。 2 CaN鈣依賴性 應(yīng)用紫外分光光度法測定不同組織中的CaN的鈣依賴性，發(fā)現(xiàn)所得不同Ca~(2+)濃度下CaN的活性變化在各組織中有共同點。隨著Ca~(2+)濃度不斷增加，CaN活性逐漸被激活，當pCa(游離Ca~(2+)濃度的負對數(shù))超過4.52時，相當于總鈣濃度為1mM，CaN活性達到最高，而隨著pCa的繼續(xù)上升，CaN活性又逐漸被抑制，即不同組織中CaN活性都表現(xiàn)為隨Ca~(2+)濃度改變而呈鐘形曲線變化。 第二部分： 1對照組與實驗組腦組織梗死體積比較 對照組與實驗組的腦組織在再灌注后，用TFC染色的方法檢測梗死體積的變化，對照組與實驗組的腦組織均出現(xiàn)了梗死區(qū)，對照組的梗死體積的百分比更大(14.83±4.37％)，實驗組的梗死體積百分比在(5.82±2.98％)的范圍之內(nèi)，P＜0.01，有統(tǒng)計學意義。 2對照組與實驗組腦組織CaN活性比較 在缺血預(yù)處理的條件下，CaN活性(nmol／min／mg protein)實驗組5.31±1.68高于對照組3.19±1.26，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。 第三部分： 1黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶所產(chǎn)生的氧自由基(OFR)對CaN活性的抑制作用 與空白組CaN活性(nmol／min／mg protein)2.63±0.41比較，對照組1.76±0.59明顯下降(P＜0.01)，黃嘌呤／黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)產(chǎn)生的OFR使CaN活性下降33.1％。 2各種抗氧化劑對CaN活性的保護作用 與對照組相比，SOD組、CAT組、DTT組CaN活性(nmol／min／mg protein)明顯增高，SOD組與對照組2.05±0.38 vs．1.76±0.59，，P＜0.05，CAT組與對照組2.40±0.48 vs．1.76±0.59，P＜0.01，DTT組與對照組2.22±0.40 vs．1.76±0.59，P＜0.01，各組分別恢復(fù)到原活性的77.9％、91.3％、84.4％，具有明顯的保護作用；而甘露醇與對照組1.78±0.62 vs．1.76±0.59，P＞0.05未發(fā)現(xiàn)有保護作用。 結(jié)論 1 CaN在大鼠體內(nèi)各器官組織有廣泛分布，可能參與多種器官組織的功能調(diào)節(jié)；鈣依賴性實驗結(jié)果表明大鼠不同器官組織中CaN對鈣依賴性有共性，高鈣引起的CaN活性抑制可能與CaN的內(nèi)源性抑制物質(zhì)有關(guān)。 2大鼠BIP可以明顯減少缺血再灌注損傷后的腦組織的梗死體積，降低腦組織的損傷程度，起到保護腦組織的作用。 3通過對氧化還原反應(yīng)的研究證實了SOD、CAT、DTT對CaN均有保護作用，而甘露醇效果不明顯�？寡趸瘎┑谋Ｗo機制則是減少OFR的釋放及其破壞作用。 4本研究結(jié)果對缺血預(yù)處理保護缺血腦組織的作用進行了證實，并且對其保護腦組織的機制有了進一步的了解，為BRI的防治提供了一定的理論指導(dǎo)和思路。
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【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R363

【參考文獻】

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1 閆力君，李大海，魏群;大鼠大腦皮層中鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活力的時空變化[J];生物化學雜志;1995年06期

2 范圣登,王琛,謝紅;Pulsinelli四血管法大鼠全腦缺血模型制作的改進[J];蘇州大學學報(醫(yī)學版);2003年04期

3 魏文青,王榮杰,叢建波,孫存普;自由基與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[J];國外醫(yī)學(生理、病理科學與臨床分冊);1999年05期

4 王春林,許鵬程,曾因明,袁麗麗,范建偉,于常州;缺血預(yù)處理對沙土鼠前腦缺血再灌注后海馬羥自由基生成的影響[J];江蘇臨床醫(yī)學雜志;2002年05期

5 張敬軍,陳青,孫思琴;海馬區(qū)星形膠質(zhì)細胞的活化狀態(tài)與缺血耐受性關(guān)系的研究[J];中國病理生理雜志;2000年02期

本文編號：2256735