發(fā)布時(shí)間：2018-09-19 14:41

【摘要】： 以食物中毒菌金黃色葡萄球菌毒素為研究對象,利用PCR方法分別擴(kuò)增出金黃色葡萄球菌腸毒素SEB1、SEB2、SED1、SED2、SEE基因片段。將克隆得到的五個(gè)毒素基因片段采用柔性的Linker序列(Gly4Ser)進(jìn)行基因串聯(lián)(SEB1-SEB2-SED1-SED2-SEE),通過PCR重疊延伸法擴(kuò)增出了融合毒素T,目的基因全長序列1835bp,包括2個(gè)Linker序列,并定向克隆到表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)的NdeI和HindIII位點(diǎn)之間,構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-T,且在表達(dá)宿主菌E. coli BL21 (DE3)中得到有效表達(dá)。表達(dá)蛋白主要以包涵體形式存在(表達(dá)量為29.6%)。將表達(dá)蛋白的包涵體經(jīng)過純化,分別免疫吉戎獺兔制備血清抗體,經(jīng)ELISA和瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測表明,表達(dá)的融合毒素T以不同的抗體效價(jià)證明保留了五種天然毒素的各自抗原性,與多種非目標(biāo)菌和毒素不反應(yīng),具有較好的特異性。說明多個(gè)基因串聯(lián)至少可達(dá)2000 bp仍能在原核載體表達(dá),至少包含2個(gè)Linker而不影響串聯(lián)基因的抗原結(jié)構(gòu)特性,表達(dá)產(chǎn)物可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生廣譜反應(yīng)特性的抗體。為融合毒素T的進(jìn)一步應(yīng)用研究以及利用融合毒素的方法檢測食物中毒菌,進(jìn)而建立食物中毒菌廣譜、快速的檢測方法奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Staphylococcus aureus enterotoxin SEB1,SEB2,SED1,SED2,SEE gene fragment was amplified by PCR method from Staphylococcus aureus toxin of food poisoning bacteria. The five toxin gene fragments were amplified by using flexible Linker sequence (Gly4Ser) for gene tandem (SEB1-SEB2-SED1-SED2-SEE). The fusion toxin T was amplified by PCR overlap extension. The full-length sequence of the target gene was 1835 BP, including two Linker sequences. The recombinant expression plasmid pET-28a () -Twas constructed between the NdeI and HindIII sites of the expression plasmid pET-28a (), and was effectively expressed in E. coli BL21 (DE3). The expressed protein was mainly in the form of inclusion body (29.6%). The inclusion bodies of the expressed protein were purified, and the serum antibodies were prepared by immunizing Jjong Rex rabbits. The results of ELISA and Agar diffusion test showed that the expressed fusion toxin T retained the antigenicity of the five natural toxins with different antibody titers. It does not react with a variety of non-target bacteria and toxins and has good specificity. The results showed that at least 2000 bp could be expressed in prokaryotic vector, and at least 2 Linker could be expressed in the prokaryotic vector without affecting the antigenic structure of the tandem gene. The expressed product could induce the body to produce antibodies of broad-spectrum reaction. It lays a foundation for the further application of fusion toxin T and the detection of food poisoning bacteria by the method of fusion toxin, and the establishment of a broad spectrum of food poisoning bacteria and a rapid detection method.
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R392

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本文編號：2250432