【摘要】： 目的：動(dòng)態(tài)觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)對(duì)異體T細(xì)胞內(nèi)因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10的影響，從而探討其抑制T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)、進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制，為其用于自身免疫性疾病治療及降低移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)發(fā)生率等提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 材料和方法：采用Ficoll密度梯度分離和體外貼壁、傳代培養(yǎng)，從人骨髓中分離、擴(kuò)增出MSCs，通過其形態(tài)的均一性及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表面標(biāo)志加以鑒定其純度；通過Ficoll分離法和尼龍棉柱法獲取外周血T淋巴細(xì)胞，以經(jīng)絲裂霉素(mitomycin-C，MMC)處理后的1×10~5／孔MSCs作為基底層細(xì)胞，接種體外分離純化的異體T淋巴細(xì)胞，分別于12h、24h、48h、72h、96h、5天后收集T淋巴細(xì)胞，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，應(yīng)用熒光定量PCR(FQ-PCR)，測(cè)定T細(xì)胞內(nèi)因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10的mRNA表達(dá)量，動(dòng)態(tài)觀察四種因子的變化趨勢(shì)，以確定下一步實(shí)驗(yàn)選擇的時(shí)間點(diǎn)。繼而將MSCs分別調(diào)整至以1×10~3、1×10~4、1×10~5個(gè)細(xì)胞／孔作為不同細(xì)胞含量組，接種于培養(yǎng)板，然后加入PHA刺激的外周血T淋巴細(xì)胞1×10~6／孔A組和含外周血單個(gè)核細(xì)胞(MNCs)與T淋巴細(xì)胞均1×10~6／孔的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)培養(yǎng)體系B組，培養(yǎng)72h，F(xiàn)Q-PCR檢測(cè)T細(xì)胞內(nèi)因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10在mRNA水平上的變化；以25％、50％和75％濃度的MSCs培養(yǎng)上清分別加入到PHA刺激的異體T淋巴細(xì)胞C組，共培養(yǎng)72h后，同樣FQ-PCR檢測(cè)T細(xì)胞內(nèi)IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10細(xì)胞因子水平。 結(jié)果：骨髓單個(gè)核細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶后，2～4天可見成纖維樣貼壁細(xì)胞出現(xiàn)，增殖速度較慢；7～10天克隆中的細(xì)胞增殖較快，呈旋渦狀或平行排列，形態(tài)均一；約2周左右，細(xì)胞融合成單層，排列有方向性。傳代細(xì)胞保持原代細(xì)胞的形態(tài)特征，生長(zhǎng)迅速，6～8天即達(dá)完全融合。對(duì)MSCs傳代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定亦顯示，3～6天是細(xì)胞快速增殖期，7天后速度減慢進(jìn)入平臺(tái)期。流式細(xì)胞儀檢測(cè)人骨髓MSCs表面抗原，其高表達(dá)CD166、CD105、CD29、CD13，低表達(dá)CD34、CD45、HLA-DR；3代以后的MSCs純度達(dá)到95％以上。 對(duì)一定數(shù)量的骨髓MSCs加入MLC體系中共培養(yǎng)，動(dòng)態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，在72h時(shí)，IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10mRNA含量基本達(dá)到穩(wěn)定：MSCs促進(jìn)IL-2、IL-4和IL-10表達(dá)(P＜0.05)，抑制IFN-γ(P＜0.05)。在A組，與未加MSCs的對(duì)照相比，不同細(xì)胞數(shù)量的MSCs和PHA作用下的T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)72h后，MSCs明顯抑制T細(xì)胞內(nèi)因子IL-2和IFN-γ的表達(dá)(P＜0.05)，而促進(jìn)IL-4和IL-10的表達(dá)(P＜0.05)，且都呈數(shù)量依賴性(P＜0.05)。在B組，與未加骨髓MSCs的對(duì)照相比，不同細(xì)胞數(shù)量的MSCs加入MLC體系中共培養(yǎng)72h后，MSCs抑制T細(xì)胞內(nèi)因子IFN-γ(P＜0.05)，增加IL-2、IL-4和IL-10的表達(dá)(P＜0.05)；MSCs對(duì)IFN-γ和IL-10的影響呈數(shù)量依賴性(P＜0.05)，但對(duì)IL-2和IL-4的影響在本組中未顯著呈現(xiàn)出MSCs數(shù)量依賴性(P＞0.05)。在C組，與未加骨髓MSCs培養(yǎng)上清的對(duì)照相比，在不同濃度的骨髓MSCs培養(yǎng)上清液和PHA作用72h后，培養(yǎng)上清可以抑制T細(xì)胞內(nèi)因子IL-2和IFN-γ表達(dá)(P＜0.05)，，且抑制呈濃度依賴性(P＜0.05)；上清液促進(jìn)IL-4表達(dá)(P＜0.05)，亦呈濃度依賴性(P＜0.05)，而對(duì)IL-10影響無(wú)顯著性(P＞0.05)。 結(jié)論：①骨髓MSCs可能通過細(xì)胞與細(xì)胞之間的直接接觸以及分泌可溶性因子調(diào)節(jié)Th1／Th2反應(yīng)平衡，抑制Th1細(xì)胞亞群的功能，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。②T細(xì)胞在不同的刺激原作用下，MSCs對(duì)其作用的機(jī)制可能不同：在PHA作用下，MSCs主要通過抑制Th1細(xì)胞亞群、增強(qiáng)Th2細(xì)胞亞群的功能，以發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用；而在同種異體抗原存在下，IL-2增加可能是T細(xì)胞受刺激增殖的表現(xiàn)。③MSCs免疫調(diào)節(jié)作用的特點(diǎn)將為免疫排斥和GVHD的防治以及自身免疫性疾病的臨床調(diào)控提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[Abstract]:AIM: To investigate the effects of bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) on allogeneic T-cell factors IL-2, IFN-gamma, IL-4 and IL-10, and to explore the mechanism of their inhibition of T-lymphocyte immune response and immunomodulation, so as to be used in the treatment of autoimmune diseases and the reduction of graft-versus-host disea (graft-versus-host disea). The incidence rate of Se, GVHD and so on provides experimental evidence.
Materials and Methods: MSCs were isolated from human bone marrow by Ficoll density gradient separation, adherence in vitro and subcultured. The purity of MSCs was determined by morphological homogeneity and flow cytometry. Peripheral blood T lymphocytes were obtained by Ficoll separation and nylon cotton column, and then mitomycin-C (mitomycin-C). After treatment with MMC, 1 1 65507 Then MSCs were adjusted to 1 10~3, 1 10~4, 1 65 Mixed lymphocyte reaction (MLR) culture system with 10-6/pore was used in group B. After 72 hours of culture, the levels of IL-2, IFN-gamma, IL-4 and IL-10 in T cells were detected by FQ-PCR, and the supernatants of MSCs with 25%, 50% and 75% concentrations were added to allogeneic T lymphocyte C stimulated by PHA respectively. After 72 hours of co-culture, the same FQ-PCR was used to detect IL-2, IFN-4 and IL-10 in T cells. Levels of gamma, IL-4 and IL-10 cytokines.
Results: After inoculating bone marrow mononuclear cells into culture flask, fibroblast-like adherent cells appeared in 2-4 days and proliferated slowly; cells in 7-10 days of cloning proliferated faster, arranged in vortex or parallel, with uniform morphology; about 2 weeks, cells fused into a single layer and arranged in a directional manner. The growth curve of MSCs passage cells also showed that the proliferation of MSCs was rapid at 3-6 days, and the rate slowed down to plateau after 7 days. Up to 95%.
After a certain number of bone marrow MSCs were co-cultured in MLC system, dynamic observation showed that at 72 hours, the levels of IL-2, IFN-gamma, IL-4 and IL-10 mRNA were basically stable: MSCs promoted the expression of IL-2, IL-4 and IL-10 (P < 0.05), inhibited IFN-gamma (P < 0.05). In group A, compared with the control without MSCs, the T lymphocytes were fine with the control without MSCs and PHA. After 72 hours of co-culture, MSCs significantly inhibited the expression of IL-2 and IFN-gamma in T cells (P < 0.05), but increased the expression of IL-4 and IL-10 (P The expression of IL-2, IL-4 and IL-10 was increased (P < 0.05), and the effect of MSCs on IFN-gamma and IL-10 was quantitatively dependent (P < 0.05), but the effect of MSCs on IL-2 and IL-4 was not quantitatively dependent (P > 0.05). After 72 hours of A treatment, the supernatant could inhibit the expression of IL-2 and IFN-gamma in T cells (P < 0.05), and the inhibition was concentration-dependent (P < 0.05); the supernatant could promote the expression of IL-4 (P < 0.05), but had no significant effect on IL-10 (P > 0.05).
CONCLUSION: Bone marrow MSCs may regulate the balance of Th1/Th2 reaction through direct contact between cells and secretion of soluble factors, inhibit the function of Th1 cell subsets and exert immunomodulatory effect. 2. Under different stimuli, the mechanism of MSCs'action may be different. Under the action of PHA, MSCs mainly inhibit the function of Th1 cell subsets. In the presence of alloantigen, the increase of IL-2 may be a sign of T cell proliferation stimulated. 3. The characteristics of MSCs immunoregulation will provide new experimental evidence for the prevention and treatment of immune rejection, GVHD and clinical regulation of autoimmune diseases.
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2234341