【摘要】： 目的: 探索耐受性樹突狀細胞(tolerogenic dendritic cells, tDCs)的體外培養(yǎng)方法,觀察不同培養(yǎng)條件下tDCs的形態(tài)學、細胞表型及功能變化,在小鼠體內(nèi)建立tDCs誘導特異性免疫耐受方法,為tDCs在預防移植免疫排斥反應和治療某些自身免疫性疾病的臨床應用提供實驗依據(jù)。 方法: 采用雄性Balb/c小鼠為供體,雌性昆明小鼠為受體。取供體小鼠骨髓細胞,分離單個核細胞。在含GM-CSF、IL-4、VIP、DXM、LPS等因子的RPMI 1640培養(yǎng)基中按不同的組合分為五組進行體外誘導培養(yǎng):空白組(不加任何因子)、常規(guī)DC組(GM-CSF+IL-4)、VIP-DC組(GM-CSF+VIP)、DXM DC組(GM-CSF+DXM)、VIP+DXM DC組(GM-CSF+VIP+DXM)。光鏡下動態(tài)觀察細胞形態(tài),流式細胞術(shù)檢測細胞CD80、CD86、CD40、CD11c表達,MTT法檢測DC刺激淋巴細胞增殖活實驗分四組:空白對照組(不經(jīng)任何處理)、骨髓細胞組(輸骨髓細胞)、常規(guī)DC組(輸常規(guī)培養(yǎng)DCs)、tDCs組(輸tDCs)。輸注細胞3天后移植供體脾片,移植后20天取移植脾片病理組織學檢查,移植后1月流式細胞術(shù)檢測受體脾單個核細胞CD80、CD86、CD40、CD11c和CD4+CD25+的表達。采用PKH26標記tDCs進行體內(nèi)定位的研究:輸PKH26標記tDCs的受體,1月后取肝、脾、淋巴結(jié)、移植脾片等印片或/和冰凍切片,熒光顯微鏡下觀察PKH26標記細胞存在數(shù)量。 結(jié)果: 1、利用GM-CSF、IL-4、VIP、DXM、LPS等因子體外培養(yǎng)能生成具有典型的樹枝狀突起DCs。常規(guī)DC組、VIP-DC組、DXM DC組、VIP+DXM DC組CD11c的表達較高,與空白組比較有顯著性差異(P0.05)。 2、VIP-DC組、DXM DC組、VIP+DXM DC組CD40、CD80和CD86表達,淋巴細胞增殖活性及培養(yǎng)上清液IL-12濃度均低于常規(guī)DC組(P0.05),VIP組以濃度為40ng/ml、DXM組以10ng/ml減低明顯,其中VIP+DXM-DC組在VIP濃度為40ng/ml、DXM為10ng/ml條件下為最低,差異明顯(P0.05)。 3、VIP-DC組、DXM DC組、VIP+DXM DC組細胞培養(yǎng)的上清液中IL-10濃度均高于常規(guī)DC組(P0.05),VIP組以濃度為40ng/ml,DXM組以10ng/ml升高明顯,其中VIP+DXM-DC組在VIP濃度為40ng/ml、DXM為10ng/ml條件下為最高,差異明顯(P0.05)。 4、小鼠體內(nèi)tDCs輸注實驗: tDCs組的移植脾片大體形態(tài)呈灰紅色,與移植部位周圍組織建立血液供應;病理學觀察組織結(jié)構(gòu)完整,未見明顯變性壞死,與正常脾組織結(jié)構(gòu)相似。而空白對照組、骨髓細胞組、常規(guī)DC組移植脾片大體呈灰白色、淺灰紅色、灰褐色,與周圍組織未建立血液供應;病理學觀察組織結(jié)構(gòu)受破壞,有的呈大片壞死。 5、tDCs組小鼠脾單個核細胞CD4+CD25+雙表達細胞為18.15±0.66%,比正常小鼠的6.5±0.55%高近3倍,有顯著性差異(P0.05);CD40、CD11c、CD80、CD86的表達比正常小鼠低,有顯著性差異(P0.05)。 6、PKH26標記tDCs體內(nèi)實驗:輸熒光染色tDCs受體小鼠的組織印片,脾臟的熒光細胞數(shù)量最多(44±3/HP)、肝臟次之(26±2/HP)、淋巴結(jié)較少(3±1/HP)。冰凍切片顯示:脾臟的熒光細胞數(shù)量最多(43±3/HP)、肝臟次之(24±2/HP)、淋巴結(jié)較少(2±1/HP)。 結(jié)論 1、小鼠骨髓單個核細胞,體外經(jīng)GM-CSF、VIP或/和DXM、LPS聯(lián)合誘導培養(yǎng)生成致耐受性樹突狀細胞(tDCs)。 2、與GM-CSF、IL-4和LPS聯(lián)合常規(guī)誘導培養(yǎng)DCs方法比較,tDCs具有CD40、CD80、CD86表達低;刺激淋巴細胞增殖弱;tDCs培養(yǎng)體系上清液IL-10水平高而IL-12水平低。 3、GM-CSF、VIP+DXM、LPS聯(lián)合誘導培養(yǎng)生成tDCs效果較佳,其中以VIP40ng/ml、DXM10ng/ml的培養(yǎng)條件為最好。 4、在移植脾片小鼠模型,經(jīng)腹腔注射tDCs能誘導受體對移植器官產(chǎn)生特異性免疫耐受。 5、小鼠體內(nèi)輸注tDCs,其脾臟CD4+CD25+Treg細胞增高,CD11c、CD40、CD80、CD86表達降低。 6、腹腔注射tDCs能遷移至脾、肝臟、淋巴結(jié),其中以脾臟分布最多。 7、腹腔注射tDCs安全性較好,并能形成穩(wěn)定的嵌合,且維持1月以上。
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【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R392

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

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本文編號：2228234