【摘要】： 目的: 探索耐受性樹突狀細(xì)胞(tolerogenic dendritic cells, tDCs)的體外培養(yǎng)方法,觀察不同培養(yǎng)條件下tDCs的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞表型及功能變化,在小鼠體內(nèi)建立tDCs誘導(dǎo)特異性免疫耐受方法,為tDCs在預(yù)防移植免疫排斥反應(yīng)和治療某些自身免疫性疾病的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法: 采用雄性Balb/c小鼠為供體,雌性昆明小鼠為受體。取供體小鼠骨髓細(xì)胞,分離單個(gè)核細(xì)胞。在含GM-CSF、IL-4、VIP、DXM、LPS等因子的RPMI 1640培養(yǎng)基中按不同的組合分為五組進(jìn)行體外誘導(dǎo)培養(yǎng):空白組(不加任何因子)、常規(guī)DC組(GM-CSF+IL-4)、VIP-DC組(GM-CSF+VIP)、DXM DC組(GM-CSF+DXM)、VIP+DXM DC組(GM-CSF+VIP+DXM)。光鏡下動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài),流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞CD80、CD86、CD40、CD11c表達(dá),MTT法檢測(cè)DC刺激淋巴細(xì)胞增殖活實(shí)驗(yàn)分四組:空白對(duì)照組(不經(jīng)任何處理)、骨髓細(xì)胞組(輸骨髓細(xì)胞)、常規(guī)DC組(輸常規(guī)培養(yǎng)DCs)、tDCs組(輸tDCs)。輸注細(xì)胞3天后移植供體脾片,移植后20天取移植脾片病理組織學(xué)檢查,移植后1月流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)受體脾單個(gè)核細(xì)胞CD80、CD86、CD40、CD11c和CD4+CD25+的表達(dá)。采用PKH26標(biāo)記tDCs進(jìn)行體內(nèi)定位的研究:輸PKH26標(biāo)記tDCs的受體,1月后取肝、脾、淋巴結(jié)、移植脾片等印片或/和冰凍切片,熒光顯微鏡下觀察PKH26標(biāo)記細(xì)胞存在數(shù)量。 結(jié)果: 1、利用GM-CSF、IL-4、VIP、DXM、LPS等因子體外培養(yǎng)能生成具有典型的樹枝狀突起DCs。常規(guī)DC組、VIP-DC組、DXM DC組、VIP+DXM DC組CD11c的表達(dá)較高,與空白組比較有顯著性差異(P0.05)。 2、VIP-DC組、DXM DC組、VIP+DXM DC組CD40、CD80和CD86表達(dá),淋巴細(xì)胞增殖活性及培養(yǎng)上清液IL-12濃度均低于常規(guī)DC組(P0.05),VIP組以濃度為40ng/ml、DXM組以10ng/ml減低明顯,其中VIP+DXM-DC組在VIP濃度為40ng/ml、DXM為10ng/ml條件下為最低,差異明顯(P0.05)。 3、VIP-DC組、DXM DC組、VIP+DXM DC組細(xì)胞培養(yǎng)的上清液中IL-10濃度均高于常規(guī)DC組(P0.05),VIP組以濃度為40ng/ml,DXM組以10ng/ml升高明顯,其中VIP+DXM-DC組在VIP濃度為40ng/ml、DXM為10ng/ml條件下為最高,差異明顯(P0.05)。 4、小鼠體內(nèi)tDCs輸注實(shí)驗(yàn): tDCs組的移植脾片大體形態(tài)呈灰紅色,與移植部位周圍組織建立血液供應(yīng);病理學(xué)觀察組織結(jié)構(gòu)完整,未見(jiàn)明顯變性壞死,與正常脾組織結(jié)構(gòu)相似。而空白對(duì)照組、骨髓細(xì)胞組、常規(guī)DC組移植脾片大體呈灰白色、淺灰紅色、灰褐色,與周圍組織未建立血液供應(yīng);病理學(xué)觀察組織結(jié)構(gòu)受破壞,有的呈大片壞死。 5、tDCs組小鼠脾單個(gè)核細(xì)胞CD4+CD25+雙表達(dá)細(xì)胞為18.15±0.66%,比正常小鼠的6.5±0.55%高近3倍,有顯著性差異(P0.05);CD40、CD11c、CD80、CD86的表達(dá)比正常小鼠低,有顯著性差異(P0.05)。 6、PKH26標(biāo)記tDCs體內(nèi)實(shí)驗(yàn):輸熒光染色tDCs受體小鼠的組織印片,脾臟的熒光細(xì)胞數(shù)量最多(44±3/HP)、肝臟次之(26±2/HP)、淋巴結(jié)較少(3±1/HP)。冰凍切片顯示:脾臟的熒光細(xì)胞數(shù)量最多(43±3/HP)、肝臟次之(24±2/HP)、淋巴結(jié)較少(2±1/HP)。 結(jié)論 1、小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞,體外經(jīng)GM-CSF、VIP或/和DXM、LPS聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)生成致耐受性樹突狀細(xì)胞(tDCs)。 2、與GM-CSF、IL-4和LPS聯(lián)合常規(guī)誘導(dǎo)培養(yǎng)DCs方法比較,tDCs具有CD40、CD80、CD86表達(dá)低;刺激淋巴細(xì)胞增殖弱;tDCs培養(yǎng)體系上清液IL-10水平高而IL-12水平低。 3、GM-CSF、VIP+DXM、LPS聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)生成tDCs效果較佳,其中以VIP40ng/ml、DXM10ng/ml的培養(yǎng)條件為最好。 4、在移植脾片小鼠模型,經(jīng)腹腔注射tDCs能誘導(dǎo)受體對(duì)移植器官產(chǎn)生特異性免疫耐受。 5、小鼠體內(nèi)輸注tDCs,其脾臟CD4+CD25+Treg細(xì)胞增高,CD11c、CD40、CD80、CD86表達(dá)降低。 6、腹腔注射tDCs能遷移至脾、肝臟、淋巴結(jié),其中以脾臟分布最多。 7、腹腔注射tDCs安全性較好,并能形成穩(wěn)定的嵌合,且維持1月以上。
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【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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1 孫爾維,陳一方,Nakajima Hiroo;用地塞米松體內(nèi)處理大鼠的脾細(xì)胞誘導(dǎo)成年大鼠同種異體免疫耐受[J];第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2000年04期

2 徐東亮;耐受性樹突狀細(xì)胞的研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).泌尿系統(tǒng)分冊(cè);2003年03期

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本文編號(hào)：2228234