【摘要】：瘧疾是世界范圍流行的嚴(yán)重威脅人類健康的寄生蟲(chóng)病。在四種人體瘧原蟲(chóng)中,惡性瘧原蟲(chóng)(Plasmodium falciparum,Pf)是引起嚴(yán)重瘧疾病癥乃至死亡的主要病原體。據(jù)WHO估計(jì),每年患病人數(shù)超過(guò)2億,死亡200—300萬(wàn),大多數(shù)為5歲以下的兒童。由于瘧原蟲(chóng)抗藥性以及蚊媒對(duì)殺蟲(chóng)劑抗性的產(chǎn)生和擴(kuò)散,使瘧疾防治面臨嚴(yán)重困難。因此,研制有效的瘧疾疫苗已成為瘧疾防治的重要途徑。瘧原蟲(chóng)裂殖子表面蛋白1(Merozoite Surface Protein 1,MSP1)是一種紅細(xì)胞內(nèi)期原蟲(chóng)表達(dá)、分布于裂殖子表面的糖蛋白。該分子是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫的主要抗原之一,尤其是其C末端的19KDa(MSP1-19)片段是其保護(hù)性免疫功能域。該片段的單抗和抗血清在體外能有效抑制瘧原蟲(chóng)的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的惡性瘧紅內(nèi)期疫苗PfCP-2.9含有該片段的組分,目前該疫苗已進(jìn)入臨床試驗(yàn)。 目前瘧疾疫苗研究遇到的最大困難之一就是缺乏廉價(jià)有效的動(dòng)物模型。盡管南美洲夜猴能感染惡性瘧原蟲(chóng),可作疫苗評(píng)價(jià)的動(dòng)物模型,但夜猴并非是惡性瘧原蟲(chóng)的天然宿主,且來(lái)源非常有限,價(jià)格昂貴。近年來(lái)瘧原蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)已日趨成熟,并已廣泛應(yīng)用于研究瘧原蟲(chóng)蛋白結(jié)構(gòu)和功能,與宿主相互作用和基因表達(dá)調(diào)控等。根據(jù)等位替換的實(shí)驗(yàn)研究表明,瘧原蟲(chóng)不同種間一些重要的功能蛋白,例如TRAP、MSP1,雖然序列上差異很大,但在功能上卻是保守的,經(jīng)同源替換后瘧原蟲(chóng)仍然能完成生活史。依據(jù)這個(gè)特點(diǎn),本研究以鼠伯氏瘧原蟲(chóng)(Plasmudium berghei,Pb)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,通過(guò)瘧原蟲(chóng)的基因打靶技術(shù)用PfMSP1-19替換內(nèi)源性的PbMSP1-19,建立瘧原蟲(chóng)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)并產(chǎn)生表達(dá)PfMSP1-19轉(zhuǎn)基因的Pb。由于此轉(zhuǎn)基因伯氏瘧原蟲(chóng)含有PfMSP1-19組分,因此用此轉(zhuǎn)基因鼠瘧原蟲(chóng)來(lái)評(píng)價(jià)PfCP-2.9疫苗體內(nèi)的免疫保護(hù)效果。 應(yīng)用專業(yè)軟件設(shè)計(jì)引物,從Pb和Pf的基因組PCR擴(kuò)增目的基因片段。在Pb中獲得來(lái)自伯氏瘧原蟲(chóng)裂殖子表面蛋白1(PbMSP-1)的1.4Kb片段和PbMSP-13’UTR的500bp片段;在Pf中獲得PfMSP-1 C末端19KDa的330bp片段。將PbMSP-1的1.4Kb與Pf的330bp的片段連接形成PbfMSP1融合基因。將PbfMSP1
[Abstract]:Malaria is a worldwide epidemic of parasitic diseases that pose a serious threat to human health. Among the four human malaria parasites, Plasmodium falciparum (Plasmodium falciparum,Pf) is the leading cause of severe malaria and even death. According to WHO estimates, more than 200 million people are sick and 2-3 million die each year, most of them children under 5 years of age. Malaria control is difficult because of the resistance of malaria parasite and the emergence and spread of mosquito vector resistance to insecticides. Therefore, the development of effective malaria vaccine has become an important way of malaria control. Plasmodium parasite merozoite surface protein (1 (Merozoite Surface Protein 1 MSP1) is a glycoprotein expressed in erythrocyte parasites and distributed on the surface of merozoites. This molecule is one of the major antigens that induce the body to produce protective immunity, especially the 19KDa (MSP1-19) fragment at its C-terminal is its protective immune functional domain. The McAb and antiserum of this fragment can effectively inhibit the growth of Plasmodium falciparum in vitro. PfCP-2.9, an internal falciparum malaria vaccine constructed in our laboratory, contains the component of this fragment, and the vaccine has been put into clinical trial. One of the biggest difficulties in malaria vaccine research is the lack of cheap and effective animal models. Although South American night monkeys can infect Plasmodium falciparum as an animal model for vaccine evaluation, night monkeys are not natural hosts of Plasmodium falciparum. In recent years, Plasmodium transgenic technology has become more and more mature, and has been widely used to study the structure and function of Plasmodium protein, interaction with host, gene expression regulation and so on. According to the experimental studies of allelic substitution, some important functional proteins in different species of Plasmodium, such as TRAP,MSP1, are conservative in function, although they differ greatly in sequence. After homologous replacement, Plasmodium can still complete its life cycle. According to this characteristic, this study took Plasmodium berghei (Plasmudium berghei,Pb) as experimental object, established the gene transfection technology of Plasmodium falciparum with PfMSP1-19 instead of endogenous PbMSP1-19, and produced the Pb. expressing PfMSP1-19 transgenic through the gene targeting technology of Plasmodium falciparum. Because the transgenic Plasmodium berghei contains PfMSP1-19 component, this transgenic mouse Plasmodium falciparum is used to evaluate the immune protection effect of PfCP-2.9 vaccine in vivo. Primers were designed to amplify the target gene fragments from the genomic PCR of Pb and Pf. 1.4Kb fragment and 500bp fragment of PbMSP-13'UTR from merozoite surface protein 1 (PbMSP-1) of Plasmodium berghei were obtained from Pb and 330bp fragment of PfMSP-1 C-terminal 19KDa from Pf. The PbfMSP1 fusion gene was formed by ligating the 1.4Kb of PbMSP-1 with the fragment of 330bp of Pf. PbfMSP1
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號(hào)】：R-332

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本文編號(hào)：2225799