【摘要】： 目的：建立Allo-A Sepharose親和層析技術(shù)分離血清中Tf和CDT，然后用直接夾心ELISA分別測(cè)定Tf和CDT水平。 方法 1．建立轉(zhuǎn)鐵蛋白直接夾心ELISA測(cè)定技術(shù)。 用抗人Tf IgG和HRP標(biāo)記羊抗人Tf抗體建立直接夾心ELISA用于Tf和CDT的定量測(cè)定。以重復(fù)率和回收率評(píng)價(jià)所建立的直接夾心ELISA。 2．Allo-A Sepharose 4B親和層析分離CDT。 用Allo-A和CNBr活化的Sepharose 4B制備Allo-A Sepharose 4B親和層析柱，用于血清Tf和CDT的分離。建立的Allo-A Sepharose 4B親和層析技術(shù)用固相pH梯度等電聚焦電泳(IPG IEF)和Western blot評(píng)價(jià)。 3．人血Tf和CDT的分離和測(cè)定 要測(cè)定的血清先由親和層析分離Tf和CDT，然后測(cè)定用直接夾心法測(cè)定洗脫液中的Tf和CDT。 結(jié)果 1．建立轉(zhuǎn)鐵蛋白直接夾心ELISA測(cè)定技術(shù) 鼠抗人Tf IgG包被濃度初步確定為2.5μg／ml。確定HRP標(biāo)記羊抗人Tf抗體最適稀釋度初步確定為1／2000。Tf的濃度與450nm光密度極為相關(guān)(R~2=0.9845)。不同濃度的人Tf標(biāo)準(zhǔn)品及血清樣品的變異系數(shù)(CV％)為1.8％～7.52％。所觀察的4份酗酒者血清，回收率為96％～105.7％。 2．Allo-A Sepharose 4B親和層析分離CDT。 2．1 Allo-A與CNBr-activated Sepharose 4B的偶聯(lián)，共進(jìn)行了4次偶聯(lián)實(shí)驗(yàn)，偶聯(lián)率為80.6～91.4％，CV=4.9％。 2．2 Allo-A Sepharose 4B親和層析分離CDT Allo-A Sepharose 4B親和層析圖譜顯示2個(gè)洗脫峰，CDT存在于第一洗脫峰，，Tf存在于第二沈脫峰。 2．3 Tf和CDT的鑒定等電聚焦電泳和免疫印記結(jié)果表明，在本實(shí)驗(yàn)確定的分離條件下，Allo-A Sepharose 4B親和層析可有效分離CDT和Tf。 3．人血Tf和CDT的測(cè)定Tf水平與OD450nm呈線性關(guān)系(R~2=0.9917)。正常人血清CDT平均水平為27.02μg／ml，99％可信限為23.1～30.9μg／ml；Tf平均水平為1998.0μg／ml，99％可信限為1606.1～2389.9μg／ml，CDT與Tf比值為1.45％。酒精性肝病患者血清CDT平均水平為36.9μg／ml，高于正常人血清CDT水平。Tf平均水平為720.7μg／ml，顯著低于正常人水平。CDT與Tf比值為5.1％。 結(jié)論 1．本實(shí)驗(yàn)建立的Tf直接夾心ELISA方法具有較理想的靈敏度、精密度和可靠性。 2．本實(shí)驗(yàn)建立的Allo-A Sepharose 4B親和層析技術(shù)適用于血清Tf和CDT分離。從Allo-A Sepharose 4B層析柱的制備到Tf和CDT的分離，操作簡(jiǎn)便易行，不需昂貴設(shè)備，因而可作為常規(guī)技術(shù)廣泛應(yīng)用。 3．通過Allo-A Sepharose 4B親和層析技術(shù)聯(lián)合使用Tf直接央心ELISA方法對(duì)20例正常人和27例酒精性肝病患者的初步觀察，發(fā)現(xiàn)酒精性肝病患者血清CDT水平高于正常人，而Tf水平則低于正常人。CDT／Tf比值在酒精性肝病患者也升高，比值的升高主要由Tf水平降低所致。 4．根據(jù)對(duì)正常人和酒精性肝病患者的觀察結(jié)果，Allo-A Sepharose 4B親和層析技術(shù)聯(lián)合使用Tf直接夾心ELISA方法可作為常規(guī)檢測(cè)技術(shù)，用于酒精性肝病的診斷。
[Abstract]:OBJECTIVE: To establish an Allo-A Sepharose affinity chromatography method for the separation of Tf and CDT in serum, and to determine the levels of Tf and CDT by direct sandwich ELISA.
Method
1. to establish a direct sandwich ELISA assay for transferrin.
A direct sandwich ELISA for the quantitative determination of Tf and CDT was established by labeling sheep anti-human Tf antibody with anti-human Tf IgG and HRP.
Separation of CDT. by affinity chromatography with 2.Allo-A Sepharose 4B
Allo-A Sepharose 4B affinity chromatography column was prepared with Allo-A and CNBr activated Sepharose 4B for the separation of Tf and CDT in serum.
Separation and determination of Tf and CDT in 3. human blood
The Tf and CDT in the eluent were separated by affinity chromatography and then determined by direct sandwich method.
Result
1. establishment of direct sandwich ELISA for transferrin detection
The optimum dilution of HRP-labelled sheep anti-human Tf antibody was determined to be 1/2000. The concentration of Tf was highly correlated with 450 nm optical density (R~2=0.9845). The coefficient of variation (CV%) of different concentrations of human Tf standard and serum samples was 1.8%-7.52%. The four alcoholic sera were observed and returned to the study. The yield is 96% ~ 105.7%..
Separation of CDT. by affinity chromatography with 2.Allo-A Sepharose 4B
2.1 The coupling experiments of Allo-A and CNBr-activated Sepharose 4B were carried out four times. The coupling rates were 80.6-91.4% and CV=4.9%.
2.2 The affinity chromatogram of CDT Allo-A Sepharose 4B showed that there were two elution peaks, CDT existed in the first elution peak and Tf existed in the second one.
Identification of 2.3 Tf and CDT by isoelectric focusing electrophoresis and immunoblotting showed that the affinity chromatography of Allo-A Sepharose 4B could effectively separate CDT and Tf under the conditions determined in this experiment.
3. There was a linear relationship between Tf and OD450nm in human serum (R~2=0.9917). The average level of CDT in normal subjects was 27.02 ug/ml, the 99% confidence limit was 23.1-30.9 ug/ml, the average level of Tf was 1998.0 ug/ml, the 99% confidence limit was 1606.1-2389.9 ug/ml, and the ratio of CDT to Tf was 1.45%. The average level of Tf was 720.7 ug/ml, which was significantly lower than the normal level. The ratio of CDT to Tf was 5.1%.
conclusion
1. the Tf direct sandwich ELISA method established in this experiment has better sensitivity, precision and reliability.
2. The affinity chromatography technique of Allo-A Sepharose 4B established in this experiment is suitable for the separation of Tf and CDT in serum.
3. By using Allo-A Sepharose 4B affinity chromatography combined with Tf direct central ELISA, the serum CDT levels in 20 normal subjects and 27 patients with alcoholic liver disease were higher than those in normal subjects, while Tf levels were lower than those in normal subjects. It is mainly caused by the decrease of Tf level.
4. According to the observation of normal people and alcoholic liver disease patients, Allo-A Sepharose 4B affinity chromatography combined with Tf sandwich ELISA can be used as a routine detection technique for the diagnosis of alcoholic liver disease.
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R392

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2211003