【摘要】：研究目的:神經(jīng)營養(yǎng)素家族是一類由靶組織分泌,具有促進和維持神經(jīng)細胞生存、生長、分化等功能的特異性蛋白質或多肽類分子。神經(jīng)營養(yǎng)素-4是第四個被發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營養(yǎng)素家族成員,研究表明神經(jīng)營養(yǎng)素-4對雞胚背根神經(jīng)節(jié)的感覺神經(jīng)元的存活和生長有促進作用。但人神經(jīng)營養(yǎng)素-4(hNT-4)在機體內含量非常低,因而限制了對它的研究。本實驗的目的就是要通過克隆hNT-4成熟蛋白基因片段,并使其在高效原核表達載體中大量表達和純化,得到高純度蛋白,為對hNT-4的進一步研究打下基礎。 研究方法:以正常人外周血淋巴細胞基因組DNA為模板,通過常規(guī)PCR擴增出hNT-4成熟蛋白基因片段。再通過雙限制性內切酶進行酶切,連接入高效原核表達載體pET32a中,重組質粒pET-NT4在大腸桿菌DH5α中進行克隆后,轉化入其表達宿主菌BL21(DE3)中進行表達。對重組菌表達條件進行優(yōu)化后,對重組菌進行擴大培養(yǎng),使其誘導表達出帶有hNT-4成熟蛋白的融合蛋白。超聲波破碎菌體后,分離出包涵體后,將包涵體溶于8M尿素后,通過Ni~(2+)-鏊合親和層析柱進行純化。 研究結果:克隆得到的hNT-4成熟蛋白基因與GeneBank報道的序列除了有一個堿基不同以外,其余的都完全相同。重組質粒pET-NT4構建正確,在表達宿主菌中表達出了預期的融合蛋白。融合蛋白主要存在于包涵體中,包涵體溶于8M尿素后,用Ni~(2+)-鏊合親和層析柱對溶解液進行純化,在0.15M咪唑洗滌液中得到的大部分融合蛋白,并且純度達到94%。 研究結論:成功擴增出人神經(jīng)營養(yǎng)素-4成熟蛋白基因片段,構建了原核表達重組質粒pET-NT4,表達得到人神經(jīng)營養(yǎng)素-4成熟蛋白和硫氧還原蛋白的融合蛋白,純化后得到了高純度(94%)的融合蛋白。
[Abstract]:Objective: the neurotrophin family is a class of specific proteins or polypeptides secreted by target tissues which can promote and maintain the survival, growth and differentiation of nerve cells. Neurotrophin-4 is the fourth member of the neurotrophin family which has been found to promote the survival and growth of sensory neurons in the dorsal root ganglion of chicken embryo. However, human neurotrophin-4 (hNT-4) is very low in the body, which limits its research. The purpose of this experiment is to clone the hNT-4 mature protein gene fragment, express and purify it in a large number in prokaryotic expression vector, and obtain the high purity protein, which will lay a foundation for the further study of hNT-4. Methods: genomic DNA of human peripheral blood lymphocytes was used as template and hNT-4 mature protein gene fragment was amplified by routine PCR. The recombinant plasmid pET-NT4 was cloned into Escherichia coli DH5 偽 and transformed into the expression host strain BL21 (DE3). After optimizing the expression conditions of the recombinant bacteria, the recombinant bacteria were expanded to express the fusion protein with hNT-4 mature protein. The inclusion bodies were separated by ultrasonic wave and dissolved in 8M urea. The inclusion bodies were purified by Ni~ (2)-chelate affinity chromatography. The results showed that the cloned hNT-4 mature protein gene was identical to the sequence reported by GeneBank except for one base. The recombinant plasmid pET-NT4 was constructed correctly and the expected fusion protein was expressed in the expressed host strain. The fusion protein was mainly present in the inclusion body. After the inclusion body was dissolved in 8M urea, the soluble solution was purified by Ni~ (2) -chelate affinity chromatography. Most of the fusion proteins were obtained in the 0.15m imidazole washing solution, and the purity of the fusion protein reached 94%. Conclusion: the human neurotrophin-4 mature protein gene fragment was amplified successfully, and the fusion protein of human neurotrophin-4 mature protein and thioxy-reducing protein was obtained by prokaryotic expression of recombinant plasmid pET-NT4,. After purification, a high purity (94%) fusion protein was obtained.
【學位授予單位】：四川大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2005
【分類號】：R341

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 徐寧;張戰(zhàn)鋒;黃憲章;陳煒燁;何敏;莊俊華;;PET32a-IL-1RⅠ重組質粒的構建及表達[J];國際檢驗醫(yī)學雜志;2011年09期

2 李田蘭;趙春亭;張忠廣;劉竹珍;劉世海;孟冬梅;張元峰;;人同源盒基因HoxB4真核表達載體的構建及鑒定[J];中國實驗血液學雜志;2011年03期

3 蔣斌;魏駿;;我國日本血吸蟲核酸疫苗的研究進展[J];華北煤炭醫(yī)學院學報;2011年04期

4 馬大偉;陳桂生;杜彥輝;;pGBKT7-hSOD1cDNA重組質粒的構建及鑒定[J];寧夏醫(yī)學雜志;2011年06期

5 婁明武;梁冰;張明東;楊廣笑;王全穎;;表達胰高血糖素樣肽1重組腺伴隨病毒載體的構建[J];中國組織工程研究與臨床康復;2011年28期

6 劉軍;徐剛;劉愛東;;MMP-13基因真核表達載體的構建及其功能研究[J];免疫學雜志;2011年08期

7 李洪濤;粟永萍;徐建明;冉新澤;王軍平;艾國平;程天民;;干擾素誘導蛋白IFIT1的克隆與原核可溶性表達[J];重慶醫(yī)學;2011年19期

8 陶紹霖;譚群友;鄧波;康珀銘;徐翼;;抑制人PC4基因表達的siRNA載體的構建與篩選[J];第三軍醫(yī)大學學報;2011年18期

9 劉洪;毛淑華;鄧麗聰;姬玲玲;徐一洲;黃英;;sKDR真核克隆表達及其對血管內皮細胞增殖的影響[J];華西藥學雜志;2011年04期

10 王云龍;孫新城;徐桂超;昌靜峰;李玉林;王國強;劉旺根;董彩文;;RNAi技術干擾人喉癌Hep-2細胞PTTG1基因的初步研究[J];實用醫(yī)學雜志;2011年16期

相關會議論文 前10條

1 宮強;劉思國;郭設平;王春來;王勇;劉建東;遲磊;趙昆;孔憲剛;;牛分枝桿菌DNA疫苗免疫效果的研究[A];中國生物工程學會2006年學術年會暨全國生物反應器學術研討會論文摘要集[C];2006年

2 劉芳;嚴懿嘉;朱建國;華修國;高謙;;牛分枝桿菌Mb1761c蛋白的表達及其免疫原性初步研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學會獸醫(yī)公共衛(wèi)生學分會成立大會暨第一次學術研討會論文集[C];2008年

3 梅明珠;嚴亞賢;陸承平;;VT2-B亞單位的重組表達及單克隆抗體的制備[A];中國畜牧獸醫(yī)學會獸醫(yī)公共衛(wèi)生學分會成立大會暨第一次學術研討會論文集[C];2008年

4 王昊鵬;張云;楊靜靜;王潔;鄧小昭;許可;;丙型肝炎雙移位F蛋白抑制肝癌細胞p16、p21的表達[A];華東地區(qū)第十次流行病學學術會議暨華東地區(qū)流行病學學術會議20周年慶典論文匯編[C];2010年

5 高明華;夏咸柱;薛琳;沈為明;韓啟茂;;狂犬病毒核蛋白基因的克隆、序列分析及其在E.coli中的高效表達[A];全國人畜共患病學術研討會論文集[C];2006年

6 陳慧峰;林育純;張樹江;李曉杰;羅潔;林麗娜;李文;胡耀明;陳雯;林忠寧;;PPP2R1A基因啟動子區(qū)高甲基化對其不同單體型轉錄功能活性影響[A];全國生化/工業(yè)與衛(wèi)生毒理學學術會議論文集[C];2010年

7 鞠會艷;夏咸柱;高玉偉;楊松濤;李彥舫;;犬瘟熱病毒核蛋白基因重組載體的構建與鑒定[A];第十一次全國養(yǎng)犬學術研討會論文集[C];2005年

8 劉桂林;趙鋒;梁志選;;CAV的VP2基因克隆及重組質粒構建的研究[A];全國動物生理生化第九次學術交流會論文摘要匯編[C];2006年

9 楊慧蘭;趙舉峰;樊建勇;周翠;黃小晏;齊維;;HSV-2潛伏相關轉錄子ORF2真核表達載體的構建及其在Vero細胞中的表達[A];中華醫(yī)學會第14次全國皮膚性病學術年會論文匯編[C];2008年

10 方瀟碧;張春鴻;林森;黃振校;吳麗萍;施清圓;廖志蘇;黃亞;李文峰;;重組質粒pENTR-CMV-EGFP-hsa-mir-16-1/15a的構建與表達[A];浙江省醫(yī)學會耳鼻咽喉科學分會成立60周年慶典暨2011年浙江省醫(yī)學會耳鼻咽喉頭頸外科學學術年會論文匯編[C];2011年

相關重要報紙文章 前10條

1 記者　耿建擴 藺玉堂;“表達凝血八因子新的重組質�！背晒ρ兄芠N];光明日報;2006年

2 嚴少慰;查游離DNA 肺癌有望早發(fā)現(xiàn)[N];健康報;2008年

3 吳一福;四軍醫(yī)大成功建立HCV多表位基因P815細胞系[N];中國醫(yī)藥報;2006年

4 張中橋;反義Cortactin基因能抑制肝癌細胞轉移[N];中國醫(yī)藥報;2006年

5 紹興縣柯橋中學 陶志堅;限制性核酸內切酶相關知識總結[N];學知報;2011年

6 ;抗肝纖維化治療期待突破[N];中國醫(yī)藥報;2006年

7 王民全;我國畜禽基因工程疫苗技術體系建設進展迅速[N];中國畜牧獸醫(yī)報;2005年

8 胡宇芬邋通訊員 周文燕;科學探索允許失敗[N];湖南日報;2007年

9 吳一福;川大成功建立人新基因PCIA1細胞株[N];中國醫(yī)藥報;2006年

10 華北制藥集團新藥中心 于文洲;發(fā)酵法制造7-氨基脫乙酰氧基頭孢烷酸技術概述[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2001年

相關博士學位論文 前10條

1 戴銀;雞MHCⅠ類分子結構與抗病性關系的研究[D];安徽農業(yè)大學;2010年

2 孫國瑛;ALI時肺內TREMs家族表達譜的變化、TREM-2的保護作用及血管活性腸肽的調控[D];中南大學;2012年

3 常彬霞;細胞色素P450 3A4、谷胱甘肽硫轉移酶A1基因轉染人肝細胞系的建立及功能測定[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院;2010年

4 崔福愛;BMP-6和VEGF表達載體的構建及其促進成骨作用的實驗研究[D];山東大學;2010年

5 管瑩;與HSV-1 UL31相互作用的宿主蛋白TMEM140生物學功能研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2011年

6 王文東;致病性大腸桿菌菌殼的研究[D];吉林大學;2010年

7 孫瑩;Stat3特異性SiRNA抑制胃癌SGC-7901細胞生長的體內外實驗研究[D];吉林大學;2010年

8 吳初新;魚類PKZ（Protein Kinase Containing Z-DNA Binding Domain）Zα與Z-DNA的結合[D];南昌大學;2010年

9 梁碩;pshuttle-Egr1-hSmac基因—放射治療乳腺癌的體外抑瘤效應研究[D];吉林大學;2011年

10 霍鑫;pEGFP-C1/Akt體外轉染MSCs對下肢缺血大鼠血管生成的影響[D];中國醫(yī)科大學;2008年

相關碩士學位論文 前10條

1 孫元田;人神經(jīng)營養(yǎng)素-4的原核表達與純化[D];四川大學;2005年

2 李茜;pcDNA3.1-preS1-GFP重組質粒的構建及其在小鼠精子內的表達[D];青島大學;2010年

3 張戰(zhàn)鋒;細胞周期依賴性蛋白激酶2重組質粒的構建與表達[D];廣州中醫(yī)藥大學;2011年

4 楊鋒;重組腎上腺髓質素對大鼠皮瓣缺血再灌注的保護作用[D];南華大學;2011年

5 劉玲娟;DNA甲基轉移酶1在同型半胱氨酸致人臍靜脈平滑肌細胞增殖中的作用研究[D];寧夏醫(yī)科大學;2011年

6 楊媚娜;β轉化生長因子受體Ⅱ啟動子熒光素酶報告基因重組質粒的構建[D];吉林大學;2012年

7 魏n，

本文編號：2201370