發(fā)布時(shí)間：2018-08-19 06:01

【摘要】： 白細(xì)胞沿著血管內(nèi)皮滾動(dòng)、穩(wěn)定粘附,最終到達(dá)炎癥部位是一個(gè)復(fù)雜的,多步驟的過程。在這個(gè)過程中有很多分子參與。選擇素家族分子對(duì)于白細(xì)胞沿著血管內(nèi)皮的滾動(dòng)起重要作用。L-選擇素是選擇素家族的一員,組成性的表達(dá)在白細(xì)胞微絨毛頂端,對(duì)白細(xì)胞與血管內(nèi)皮的起始粘附起主要作用。L-選擇素不僅可以作為一個(gè)粘附分子,還能作為一個(gè)信號(hào)分子在粘附事件中發(fā)揮作用。L-選擇素與其單克隆抗體的結(jié)合,能引起細(xì)胞形態(tài)變化,細(xì)胞骨架重排,氧呼吸爆發(fā),細(xì)胞內(nèi)IL-8以及TNFα基因的表達(dá)上調(diào)等。在L-選擇素起始的信號(hào)事件中,有激酶分子的參與,但具體的分子機(jī)制還很不清楚。c-Abl激酶是一類非受體酪氨酸激酶,具有F-肌動(dòng)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域,能夠被整合素以及生長因子受體結(jié)合而活化,從而調(diào)節(jié)F-肌動(dòng)蛋白依賴的細(xì)胞骨架的變化。我們推測(cè),c-Abl激酶也可能參與了L-選擇素交聯(lián)起始的信號(hào)事件。本文主要探討了c-Abl分子是否以及如何參與了由L-選擇素交聯(lián)起始的信號(hào)事件。 c-Abl的激酶活性在細(xì)胞內(nèi)受到分子間和分子內(nèi)雙重的嚴(yán)格調(diào)控。我們的研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)L-選擇素交聯(lián)以后,c-Abl激酶活性增強(qiáng)。如果在活化細(xì)胞前用c-Abl的抑制劑處理細(xì)胞,則c-Abl的激酶活性降低。c-Abl的激酶活性變化和L-選擇素交聯(lián)引起的F-肌動(dòng)蛋白的變化相一致。在活化的細(xì)胞內(nèi),c-Abl的定位也發(fā)生變化。在靜止細(xì)胞中,c-Abl激酶均勻的分布在整個(gè)細(xì)胞中,而L-選擇素交聯(lián)活化的細(xì)胞內(nèi),c-Abl激酶聚集在F-肌動(dòng)蛋白以及L-選擇素富集的部位。在細(xì)胞活化前用c-Abl的激酶抑制劑處理,三者的共定位現(xiàn)象消失。用抑制F-肌動(dòng)蛋白聚合的抑制劑CB處理活化前的細(xì)胞,三者的共定位現(xiàn)象也減弱。說明L-選擇素交聯(lián)引起的F-肌動(dòng)蛋白依賴的細(xì)胞骨架的變化依賴于c-Abl激酶的活性。 c-Abl激酶還參與了由L-選擇素交聯(lián)引起的集落刺激因子-1(CSF-1)基因的表達(dá)。過表達(dá)野生型而不是激酶突變型的c-Abl能夠增強(qiáng)由L-選擇素交聯(lián)引起的CSF-1基因的表達(dá)上調(diào)。用c-Abl激酶抑制劑處理活化前的細(xì)胞則降低了由c-Abl過表達(dá)引起的CSF-1基因的表達(dá)。說明L-選擇素交聯(lián)引起的CSF-1基因的表達(dá)增強(qiáng)依賴于c-Abl的激酶活性。ZAP70激酶是T細(xì)胞活化后最先被活化的分子之一。過表達(dá)野生型而不是激酶突變型或者Y319F突變型的ZAP70也能增強(qiáng)CSF-1基因的表達(dá)增強(qiáng)。在L-選擇素交聯(lián)活化以前,用c-Abl以及ZAP70抑制劑處理發(fā)現(xiàn)c-Abl激酶通過調(diào)節(jié)ZAP70 Y319的磷酸化來調(diào)節(jié)CSF-1基因的表達(dá)。 通過蛋白質(zhì)免疫共沉淀以及GST-pull down實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)在L-選擇素活化的T細(xì)胞內(nèi),L-選擇素、c-Abl以及ZAP70三者結(jié)合在一起。通過L-選擇素不同刺激時(shí)間來檢測(cè)三者的結(jié)合關(guān)系,我們發(fā)現(xiàn)c-Abl激酶和L-選擇素組成性的結(jié)合在一起,隨著L-選擇素交聯(lián)時(shí)間的增加,更多的ZAP70聚集到c-Abl激酶的SH2結(jié)構(gòu)域。 我們的結(jié)果證明了L-選擇素交聯(lián)引起的信號(hào)事件中,c-Abl激酶起到了很重要的作用。它不僅通過激酶活性的變化來調(diào)節(jié)F-肌動(dòng)蛋白依賴的細(xì)胞骨架的變化,還能通過和L-選擇素胞漿尾部結(jié)合,接受并傳遞由L-選擇素交聯(lián)引起的信號(hào)事件。將上游的信號(hào)事件通過與下游的底物結(jié)合來傳遞從而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)。
[Abstract]:Leukocytes roll along the vascular endothelium, adhere steadily, and eventually reach the inflammation site. There are many molecules involved in this process. The selectin family molecules play an important role in the leukocyte rolling along the vascular endothelium. L-selectin is a member of the selectin family, which is constitutively expressed in leukocytes. L-selectin not only acts as an adhesion molecule, but also as a signal molecule in adhesion events. The binding of L-selectin with its monoclonal antibody can cause cell morphological changes, cytoskeleton rearrangement, oxygen respiration explosion, and intracellular IL-2. C-Abl kinases are a class of non-receptor tyrosine kinases with F-actin binding domains that can be activated by integrins and growth factor receptors, thereby regulating F-myocardium. We speculate that c-Abl kinase may also be involved in signal events that initiate L-selectin cross-linking. In this paper, we mainly discuss whether and how c-Abl molecules participate in signal events initiated by L-selectin cross-linking.
The activity of c-Abl kinase is strictly regulated by both intracellular and intramolecular mechanisms. Our study found that the activity of c-Abl kinase increases after L-selectin cross-linking. If cells are treated with c-Abl inhibitors before activation, the activity of c-Abl kinase decreases. In stationary cells, c-Abl kinases are uniformly distributed throughout the cell, while in L-selectin-crosslinked activated cells, c-Abl kinases are concentrated in F-actin and L-selectin-enriched sites. After treatment, the co-localization phenomenon disappeared, and the co-localization phenomenon was also weakened in the activated cells treated with CB, an inhibitor of F-actin polymerization. It was suggested that the changes of F-actin-dependent cytoskeleton induced by L-selectin cross-linking depended on the activity of c-Abl kinase.
C-Abl kinase also participates in the expression of colony-stimulating factor-1 (CSF-1) gene induced by L-selectin cross-linking. Overexpression of wild-type but not kinase mutant c-Abl enhances the up-regulation of CSF-1 gene induced by L-selectin cross-linking. Cells treated with c-Abl kinase inhibitors before activation decrease the C-Abl overexpression. The expression of SF-1 gene showed that the expression of CSF-1 gene was enhanced by L-selectin cross-linking, which was dependent on the activity of c-Abl kinase. ZAP70 kinase was one of the first molecules activated after T cell activation. Overexpression of wild type ZAP70 instead of kinase mutant or Y319F mutant ZAP70 also enhanced the expression of CSF-1 gene. Before activation, c-Abl and ZAP70 inhibitors were used to regulate the expression of CSF-1 gene by regulating the phosphorylation of ZAP70 Y319.
We found that L-selectin, c-Abl and ZAP70 bind together in L-selectin-activated T cells by protein immunoprecipitation and GST-pull down assay. By examining the binding relationship of L-selectin with different stimulation time, we found that c-Abl kinase and L-selectin bind together in composition with L-selection. With the increase of the cross linking time, more ZAP70 aggregates into the SH2 domain of c-Abl kinase.
Our results demonstrate that c-Abl kinase plays an important role in signal events induced by L-selectin crosslinking. It not only regulates F-actin-dependent cytoskeleton changes through changes in kinase activity, but also receives and transmits signal events induced by L-selectin crosslinking by binding to the tail of L-selectin cytoplasm. The upstream signal events are passed through the downstream substrate to regulate the expression of genes in the cell.
【學(xué)位授予單位】：東北師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R341

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本文編號(hào)：2190856