【摘要】：背景 肝臟疾病危害人類健康,肝功能衰竭、重型肝炎和肝癌等疾病的死亡率高達 65%-85%,雖然原位肝臟移植在一定程度上可以緩解病情,幫助病人度過危險期,但是由于肝臟器官來源匱乏,術(shù)后免疫排斥反應(yīng)和巨額的手術(shù)治療費用等因素,都使得這一治療措施不能廣泛的應(yīng)用。 肝臟組織工程( Engineering Liver Regeneration)是近年來正在興起的,由生物學、醫(yī)學、材料科學、生物醫(yī)學工程學等學科交叉產(chǎn)生的一門高新技術(shù)學科,最終的目標是永久性的修復(fù)和取代人類病損的肝臟組織,從而徹底的治愈肝臟疾病,這為肝臟疾病的治療開辟了全新的思路。肝臟組織工程研究包括種子細胞的研究、細胞外基質(zhì)的研究和組織器官的構(gòu)建等三部分。其中,種子細胞選取,是一切研究的基礎(chǔ)。隨著人們對干細胞研究的逐步深入,選取干細胞作為種子細胞越來越為人們所關(guān)注,尤其是自體干細胞。已經(jīng)有研究表明骨髓來源的干細胞具有多向分化潛能,在體外可以分化為骨、軟骨、肌肉、神經(jīng)、脂肪細胞和肝細胞等。在骨髓中存在兩種主要的干細胞:造血干細胞(Hematopoietic stem cell HSCs)和間充質(zhì)干細胞 (Mesenchymal stem cells MSCs),已經(jīng)有研究表明:間充質(zhì)干細胞在體外不同條件下可以定向的被誘導分化為成骨細胞[1]、成軟骨細胞[2]、脂肪細胞[3]、肌肉細胞[4]、神經(jīng)元細胞[5]等不同細胞,因其具有高度的自我更新能 力和多向分化潛能以及取材方便、自體植入后不良反映較弱等優(yōu)點,將成為肝臟組織工程的理想種子細胞。 目前,MSCs 在骨、軟骨、和肌腱損傷的修復(fù)方面研究比較深入,但在體外向肝細胞誘導分化的條件和機制方面剛剛起步,而且面臨一系列的困難:如何模擬體內(nèi)微環(huán)境使骨髓間充質(zhì)干細胞定向肝細胞分化;如何提高誘導分化效率;建立高效完整的擴增體系等。 研究目的 探討 MSCs 在體外是否具有定向分化為功能性的肝細胞的潛能。 方法與結(jié)果 本實驗第一部分首先分離、培養(yǎng)并鑒定 MSCs。利用骨髓間充質(zhì)干細胞的密度特性,用一定密度的 Percoll 對提取出的骨髓進行密度梯度分離。1.073g/mL 密度梯度離心法結(jié)合貼壁法分離小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞,經(jīng)傳代培養(yǎng)后,取第 3 代的 MSCs,觀察不同的血清濃度、種植密度對細胞體外生長的影響,觀察細胞生長曲線,并應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞表面抗原。第 3 代的 MSCs 經(jīng)過流式細胞儀鑒定發(fā)現(xiàn):培養(yǎng)的第 3 代 MSCs,干細胞表面標志 CD90 陽性,基質(zhì)細胞表面標志 CD44 陽性,不表達內(nèi)皮細胞表面標志 CD31 不表達白細胞表面標志 D45;不表達造血干細胞表面標志 CD34。說明在第 3 代的 MSCs中不含有造血干細胞,其他雜質(zhì)細胞含量少,已經(jīng)成為比較純的MSCs.,為下一步的實驗奠定基礎(chǔ)。 本實驗第二部分探討 MSCs 是否具有定向肝細胞分化的潛能。取第 3 代骨髓間充質(zhì)干細胞,0.25%胰酶消化,臺盼蘭拒染試驗顯示細胞活率大于 95%,以 1×105/mm 的密度種植在 24 孔和 6 孔培養(yǎng)板中。約 7-12 天,細胞鋪滿板底。單獨應(yīng)用 HGF、EGF 及 HGF 聯(lián)合 EGF對 MSCs 進行誘導,各組加入誘導因子后,MSCs 分裂增殖逐漸停止,開始有少量細胞發(fā)生形態(tài)學的改變,梭形細胞的兩極開始回縮,細胞開始由梭形變圓。其中 HGF 和 EGF 聯(lián)合誘導組的 MSCs 在 48h內(nèi)就部分細胞變圓;而單獨應(yīng)用 HGF 組和單獨應(yīng)用 EGF 組在 48h 內(nèi)細胞無明顯改變,而在 72h 后可以發(fā)現(xiàn)有部分細胞變圓;誘導 10 天后,各組變圓細胞均有“聚集”現(xiàn)象出現(xiàn)。誘導分化 20 天,各組細
[Abstract]:background
Liver disease is harmful to human health. The mortality rate of liver failure, severe hepatitis and liver cancer is 65%-85%. Although orthotopic liver transplantation can alleviate the disease to a certain extent and help patients through the dangerous period, due to the lack of liver organs, immune rejection after surgery and huge surgical costs, etc. This treatment can not be widely applied.
Engineering Liver Regeneration (ELR) is a new and high-tech subject emerging in recent years. It is produced by the interdisciplinary of biology, medicine, materials science, biomedical engineering and so on. The ultimate goal is to repair and replace the damaged liver tissue permanently, thus completely curing the liver disease. This is the liver. Liver tissue engineering research includes three parts: seed cell research, extracellular matrix research and tissue organ construction. Seed cell selection is the basis of all research. With the development of stem cell research, stem cells as seed cells become more and more important. There are two main types of stem cells in bone marrow: hematopoietic stem cells (HSCs) and mesenchymal stem cells (MSCs). Mesenchymal stem cells MSCs have been shown to differentiate into osteoblasts [1], chondroblasts [2], adipocytes [3], muscle cells [4], neurons [5] under different conditions in vitro, because of their high self-renewal capacity.
It will be an ideal seed cell for liver tissue engineering because of its strength, multidirectional differentiation potential, convenience of sampling and poor response after autologous implantation.
At present, MSCs have been extensively studied in repairing bone, cartilage, and tendon injuries. However, the conditions and mechanisms of inducing differentiation into hepatocytes in vitro are just beginning, and a series of difficulties are confronted: how to simulate the microenvironment in vivo to make bone marrow mesenchymal stem cells differentiate into hepatocytes; how to improve the efficiency of inducing differentiation; Complete amplification system.
research objective
To investigate whether MSCs has potential to differentiate into functional hepatocytes in vitro.
Methods and results
In the first part of this experiment, MSCs were isolated, cultured and identified. MSCs of the third generation were obtained by density gradient separation of the extracted bone marrow with a certain density of Percoll. 1.073g/ml density gradient centrifugation combined with adherence method. The effect of different serum concentration and planting density on the cell growth in vitro was observed. The growth curve was observed and the cell surface antigen was detected by flow cytometry. CD31, the endothelial cell surface marker, did not express the leukocyte surface marker D45; CD34, the hematopoietic stem cell surface marker, did not express the hematopoietic stem cell surface marker CD34.
The second part of this study was to investigate whether MSCs have the potential to differentiate into hepatocytes. The third generation bone marrow mesenchymal stem cells were digested with 0.25% trypsin. Trypan blue exclusion test showed that the cell viability was more than 95%. The cells were planted in 24-hole and 6-hole plates at a density of 1 105/mm for about 7-12 days. The cells were covered with the bottom of the plate. MSCs were induced by HGF combined with EGF. After the induction factors were added to each group, the division and proliferation of MSCs stopped gradually, and a few cells began to undergo morphological changes. The polarity of spindle cells began to shrink, and the cells began to circle by spindle. There was no obvious change in the cells of the two groups within 48 hours, but some cells became round after 72 hours. After 10 days of induction, the cells in each group showed "aggregation" phenomenon.
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2005
【分類號】：R329

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