【摘要】：背景 肝臟疾病危害人類健康,肝功能衰竭、重型肝炎和肝癌等疾病的死亡率高達(dá) 65%-85%,雖然原位肝臟移植在一定程度上可以緩解病情,幫助病人度過危險(xiǎn)期,但是由于肝臟器官來源匱乏,術(shù)后免疫排斥反應(yīng)和巨額的手術(shù)治療費(fèi)用等因素,都使得這一治療措施不能廣泛的應(yīng)用。 肝臟組織工程( Engineering Liver Regeneration)是近年來正在興起的,由生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、材料科學(xué)、生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)等學(xué)科交叉產(chǎn)生的一門高新技術(shù)學(xué)科,最終的目標(biāo)是永久性的修復(fù)和取代人類病損的肝臟組織,從而徹底的治愈肝臟疾病,這為肝臟疾病的治療開辟了全新的思路。肝臟組織工程研究包括種子細(xì)胞的研究、細(xì)胞外基質(zhì)的研究和組織器官的構(gòu)建等三部分。其中,種子細(xì)胞選取,是一切研究的基礎(chǔ)。隨著人們對(duì)干細(xì)胞研究的逐步深入,選取干細(xì)胞作為種子細(xì)胞越來越為人們所關(guān)注,尤其是自體干細(xì)胞。已經(jīng)有研究表明骨髓來源的干細(xì)胞具有多向分化潛能,在體外可以分化為骨、軟骨、肌肉、神經(jīng)、脂肪細(xì)胞和肝細(xì)胞等。在骨髓中存在兩種主要的干細(xì)胞:造血干細(xì)胞(Hematopoietic stem cell HSCs)和間充質(zhì)干細(xì)胞 (Mesenchymal stem cells MSCs),已經(jīng)有研究表明:間充質(zhì)干細(xì)胞在體外不同條件下可以定向的被誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞[1]、成軟骨細(xì)胞[2]、脂肪細(xì)胞[3]、肌肉細(xì)胞[4]、神經(jīng)元細(xì)胞[5]等不同細(xì)胞,因其具有高度的自我更新能 力和多向分化潛能以及取材方便、自體植入后不良反映較弱等優(yōu)點(diǎn),將成為肝臟組織工程的理想種子細(xì)胞。 目前,MSCs 在骨、軟骨、和肌腱損傷的修復(fù)方面研究比較深入,但在體外向肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化的條件和機(jī)制方面剛剛起步,而且面臨一系列的困難:如何模擬體內(nèi)微環(huán)境使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向肝細(xì)胞分化;如何提高誘導(dǎo)分化效率;建立高效完整的擴(kuò)增體系等。 研究目的 探討 MSCs 在體外是否具有定向分化為功能性的肝細(xì)胞的潛能。 方法與結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)第一部分首先分離、培養(yǎng)并鑒定 MSCs。利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的密度特性,用一定密度的 Percoll 對(duì)提取出的骨髓進(jìn)行密度梯度分離。1.073g/mL 密度梯度離心法結(jié)合貼壁法分離小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,經(jīng)傳代培養(yǎng)后,取第 3 代的 MSCs,觀察不同的血清濃度、種植密度對(duì)細(xì)胞體外生長的影響,觀察細(xì)胞生長曲線,并應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原。第 3 代的 MSCs 經(jīng)過流式細(xì)胞儀鑒定發(fā)現(xiàn):培養(yǎng)的第 3 代 MSCs,干細(xì)胞表面標(biāo)志 CD90 陽性,基質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志 CD44 陽性,不表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志 CD31 不表達(dá)白細(xì)胞表面標(biāo)志 D45;不表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)志 CD34。說明在第 3 代的 MSCs中不含有造血干細(xì)胞,其他雜質(zhì)細(xì)胞含量少,已經(jīng)成為比較純的MSCs.,為下一步的實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 本實(shí)驗(yàn)第二部分探討 MSCs 是否具有定向肝細(xì)胞分化的潛能。取第 3 代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,0.25%胰酶消化,臺(tái)盼蘭拒染試驗(yàn)顯示細(xì)胞活率大于 95%,以 1×105/mm 的密度種植在 24 孔和 6 孔培養(yǎng)板中。約 7-12 天,細(xì)胞鋪滿板底。單獨(dú)應(yīng)用 HGF、EGF 及 HGF 聯(lián)合 EGF對(duì) MSCs 進(jìn)行誘導(dǎo),各組加入誘導(dǎo)因子后,MSCs 分裂增殖逐漸停止,開始有少量細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)的改變,梭形細(xì)胞的兩極開始回縮,細(xì)胞開始由梭形變圓。其中 HGF 和 EGF 聯(lián)合誘導(dǎo)組的 MSCs 在 48h內(nèi)就部分細(xì)胞變圓;而單獨(dú)應(yīng)用 HGF 組和單獨(dú)應(yīng)用 EGF 組在 48h 內(nèi)細(xì)胞無明顯改變,而在 72h 后可以發(fā)現(xiàn)有部分細(xì)胞變圓;誘導(dǎo) 10 天后,各組變圓細(xì)胞均有“聚集”現(xiàn)象出現(xiàn)。誘導(dǎo)分化 20 天,各組細(xì)
[Abstract]:background
Liver disease is harmful to human health. The mortality rate of liver failure, severe hepatitis and liver cancer is 65%-85%. Although orthotopic liver transplantation can alleviate the disease to a certain extent and help patients through the dangerous period, due to the lack of liver organs, immune rejection after surgery and huge surgical costs, etc. This treatment can not be widely applied.
Engineering Liver Regeneration (ELR) is a new and high-tech subject emerging in recent years. It is produced by the interdisciplinary of biology, medicine, materials science, biomedical engineering and so on. The ultimate goal is to repair and replace the damaged liver tissue permanently, thus completely curing the liver disease. This is the liver. Liver tissue engineering research includes three parts: seed cell research, extracellular matrix research and tissue organ construction. Seed cell selection is the basis of all research. With the development of stem cell research, stem cells as seed cells become more and more important. There are two main types of stem cells in bone marrow: hematopoietic stem cells (HSCs) and mesenchymal stem cells (MSCs). Mesenchymal stem cells MSCs have been shown to differentiate into osteoblasts [1], chondroblasts [2], adipocytes [3], muscle cells [4], neurons [5] under different conditions in vitro, because of their high self-renewal capacity.
It will be an ideal seed cell for liver tissue engineering because of its strength, multidirectional differentiation potential, convenience of sampling and poor response after autologous implantation.
At present, MSCs have been extensively studied in repairing bone, cartilage, and tendon injuries. However, the conditions and mechanisms of inducing differentiation into hepatocytes in vitro are just beginning, and a series of difficulties are confronted: how to simulate the microenvironment in vivo to make bone marrow mesenchymal stem cells differentiate into hepatocytes; how to improve the efficiency of inducing differentiation; Complete amplification system.
research objective
To investigate whether MSCs has potential to differentiate into functional hepatocytes in vitro.
Methods and results
In the first part of this experiment, MSCs were isolated, cultured and identified. MSCs of the third generation were obtained by density gradient separation of the extracted bone marrow with a certain density of Percoll. 1.073g/ml density gradient centrifugation combined with adherence method. The effect of different serum concentration and planting density on the cell growth in vitro was observed. The growth curve was observed and the cell surface antigen was detected by flow cytometry. CD31, the endothelial cell surface marker, did not express the leukocyte surface marker D45; CD34, the hematopoietic stem cell surface marker, did not express the hematopoietic stem cell surface marker CD34.
The second part of this study was to investigate whether MSCs have the potential to differentiate into hepatocytes. The third generation bone marrow mesenchymal stem cells were digested with 0.25% trypsin. Trypan blue exclusion test showed that the cell viability was more than 95%. The cells were planted in 24-hole and 6-hole plates at a density of 1 105/mm for about 7-12 days. The cells were covered with the bottom of the plate. MSCs were induced by HGF combined with EGF. After the induction factors were added to each group, the division and proliferation of MSCs stopped gradually, and a few cells began to undergo morphological changes. The polarity of spindle cells began to shrink, and the cells began to circle by spindle. There was no obvious change in the cells of the two groups within 48 hours, but some cells became round after 72 hours. After 10 days of induction, the cells in each group showed "aggregation" phenomenon.
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：2184153