【摘要】：DEAD-box蛋白家族的ATP依賴的RNA解旋酶類參與細(xì)胞內(nèi)幾乎所有的RNA代謝過程,在幾乎所有生物的細(xì)胞生長發(fā)育過程中扮演著眾多不可或缺的角色。瘧疾目前仍然是世界上許多地方的一個主要的健康問題;控制瘧疾的一個可行的辦法就是研制出通過阻斷瘧原蟲生長有關(guān)的關(guān)鍵酶來抑制其生長的藥物,比如通過阻斷DNA/RNA解旋酶等。按照此思路,我們進(jìn)行了有關(guān)瘧原蟲DNA/RNA解旋酶的研究。本研究主要開展了兩個方面的工作:1.克隆了Plasmodium flaciparum abstrakt全長基因,分析了該蛋白的結(jié)構(gòu);并且依據(jù)不同DEAD-box蛋白的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了初步歸類。2.克隆了Plasmodium.cynomolgi eIF-4A完整cDNA,表達(dá)了該重組蛋白并對其ATPase活性進(jìn)行了檢測。 在本實驗中,通過PCR和探針雜交相結(jié)合的篩選方法,篩選惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)的基因組文庫,克隆了FH1F—abstrakt同源基因的完整序列。通過搜索已經(jīng)完成測序的惡性瘧原蟲基因組數(shù)據(jù)庫,推測FH1F序列定位在第5條連鎖群上。FH1F全長2804bp,包含一個1161bp的完整閱讀框,編碼一個由386個氨基酸組成的蛋白。對FH1F蛋白序列用Blast P進(jìn)行搜索和分析以及用DNAStar與許多典型的DEAD-box蛋白序列進(jìn)行比對分析,結(jié)果均提示FH1F蛋白應(yīng)該是DEAD-box家族的一個Abstrakt蛋白。另一方面,用DNAStar對已知所有完整的DEAD-box蛋白進(jìn)行詳細(xì)的序列分析以及用Mega對這些序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育研究的結(jié)果都顯示: DEAD-box家族的蛋白聚類成為若干不同的亞家族;與DEAD-box蛋白的一般保守序列相比,Abstrakt,eIF-4A,Vasa,P68等不同亞群的DEAD-box蛋白在保守區(qū)具有各自不同的結(jié)構(gòu)特征。本文對不同的DEAD-box蛋白的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了總結(jié)并試圖給出不同亞群分類上的結(jié)構(gòu)標(biāo)準(zhǔn),對Abstrakt蛋白在本應(yīng)高度保守的位點(diǎn)上異常于其它DEAD-box蛋白的氨基酸殘基的取代也進(jìn)行了相關(guān)的初步分析。 采用同樣的基因克隆方法篩選食蟹猴瘧原蟲(Plasmodium cynomolgi)的cDNA文庫,克隆了一個eIF-4A同源蛋白的完整cDNA序列,命名為CH1F。CH1F全長1753bp,包含一個1197bp的完整閱讀框,推測編碼一個由398個氨基酸組成的蛋白。對CH1F的蛋白序列用BlastP進(jìn)行搜索和分析,提示它應(yīng)該是DEAD-box家族的一個eIF-4A同源蛋白;用DXAStar將其與許多典型的DEAD-box蛋白序列進(jìn)行比對分析,結(jié)果顯示:比起其它的DEAD-box蛋白,它與eIF-4A或eIF-4A的同源蛋白具有更高的一致性和更多序列上的相似結(jié)構(gòu)域。將包含完整閱讀框的片段亞克隆到表達(dá)載體pET-28a(+),在大腸桿菌DH5α中表達(dá),產(chǎn)生的融合蛋白大小在45kD左右。對該融合蛋白進(jìn)行純化、重新折疊和初步鑒定。ATP酶活性檢測顯示,該融合蛋白只有很低的ATP酶活性,而且它的ATP酶活性似乎不依賴于核酸底物。對這一檢測結(jié)果給出3種
[Abstract]:The ATP dependent RNA helicases of the DEAD-box protein family are involved in almost all RNA metabolism processes in the cells and play many indispensable roles in the cell growth and development of almost all organisms. Malaria is still a major health problem in many parts of the world; a viable way to control malaria is to develop drugs that inhibit the growth of malaria parasites by blocking the key enzymes involved in their growth. For example, by blocking the DNA/RNA helicase and so on. According to this idea, we studied the DNA/RNA helicase of Plasmodium falciparum. This study mainly carried out two aspects of work: 1. The full-length Plasmodium flaciparum abstrakt gene was cloned, the structure of the protein was analyzed, and the structural characteristics of different DEAD-box proteins were preliminarily classified. 2. The complete cDNAs of Plasmodium.cynomolgi eIF-4A were cloned, the recombinant protein was expressed and its ATPase activity was detected. In this experiment, the genomic library of Plasmodium falciparum (Plasmodium falciparum) was screened by PCR and probe hybridization, and the complete sequence of FH1F-abstrakt homologous gene was cloned. By searching the genomic database of Plasmodium falciparum which has been sequenced, we speculated that the FH1F sequence was located on the fifth linkage group. FH1 F contained a complete reading frame of 1161bp, encoding a 386-amino acid protein. The FH1F protein sequence was searched and analyzed by Blast P and compared with many typical DEAD-box protein sequences by DNAStar. The results indicated that FH1F protein should be a Abstrakt protein of DEAD-box family. On the other hand, Detailed sequence analysis of all known complete DEAD-box proteins using DNAStar and phylogenetic analysis of these sequences using Mega show that: DEAD-box The proteins of the family were clustered into several different subfamilies. Compared with the general conserved sequence of DEAD-box protein, the DEAD-box proteins of different subgroups, such as Abstraktttene eIF-4ANAP68 and so on, have different structural characteristics in the conserved region. In this paper, the structural characteristics of different DEAD-box proteins were summarized and the structural criteria of different subgroups were proposed. The substitution of amino acid residues of Abstrakt protein on the sites that were supposed to be highly conserved to other DEAD-box proteins were also analyzed. The cDNA library of Plasmodium falciparum (Plasmodium cynomolgi) was screened by the same gene cloning method, and a complete cDNA sequence of eIF-4A homologous protein was cloned, named CH1F.CH1F 1753 BP, which contains a complete reading frame of 1197bp. It is supposed to encode a protein consisting of 398 amino acids. The protein sequence of CH1F was searched and analyzed by BlastP, which suggested that it should be a eIF-4A homologous protein of DEAD-box family, and compared with many typical DEAD-box protein sequences by DXAStar, the results showed that it was better than other DEAD-box proteins. It is more consistent with eIF-4A or eIF-4A homologous proteins and has more similar domains. The fragment containing the complete reading frame was subcloned into the expression vector pET-28a (), and expressed in Escherichia coli DH5 偽. The size of the fusion protein was about 45kD. The fusion protein was purified, refolded and preliminarily identified. The results showed that the fusion protein had very low ATP activity, and its ATP activity did not seem to be dependent on the nucleic acid substrate. Three kinds of results are given for this test.
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號】：R346

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5 陳f，

本文編號：2166419