【摘要】： 流感是一種流感病毒引起的嚴(yán)重性呼吸道疾病。流感病毒(Influenza virus，Ⅳ)具有高度傳染性，能在短期內(nèi)突然發(fā)生，迅速蔓延，造成不同程度的流行，甚至世界大流行，導(dǎo)致全球人力資源和物力資源的重大損失。流感病毒的主要表面抗原之一—血凝素(HA)，具有高度變異性，致使流感病毒疫苗一般每年都要更換，給疫苗的制備和生產(chǎn)造成了諸多不便。而流感病毒的跨膜蛋白—基質(zhì)蛋白2(M2蛋白)，含有高度保守的抗原表位，是病毒亞型間交叉保護(hù)性疫苗的候選抗原。流感病毒變異速度非常快，尤其是當(dāng)前禽流感病毒逐漸蔓延到人群中，對(duì)人類危害越來(lái)越大，因此研制出一種新穎的具有廣泛保護(hù)作用的疫苗對(duì)于控制流感病毒流行具有極其重要的意義。 本研究選擇了A型流感病毒的缺失跨膜區(qū)M2以及H1N1和H3N2亞型流感病毒HA的7個(gè)保守的B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位。采用大腸桿菌偏愛的密碼子對(duì)M2外膜區(qū)基因和HA多表位基因進(jìn)行了優(yōu)化設(shè)計(jì)。通過合成引物，利用重疊延伸PCR(OE-PCR)和搭橋式PCR方法分別擴(kuò)增得到A型流感病毒M2蛋白缺失跨膜區(qū)基因和HA多表位基因，依次克隆到表達(dá)載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a+-M2d-HA，經(jīng)測(cè)序表明，插入表達(dá)載體中的外源基因的序列與理論設(shè)計(jì)的基因序列完全一致。 將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，，篩選獲得了高效表達(dá)重組融合蛋白的工程菌，表達(dá)重組蛋白約占菌體總蛋白總量的45％左右。表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在，經(jīng)包涵體處理，親和層析純化后，重組蛋白稀釋復(fù)性，再經(jīng)陰離子交換層析純化得到純度在90％以上的目的蛋白。Western blot結(jié)果顯示純化的重組蛋白具有較好的抗原性和特異性。重組蛋白免疫小鼠后，利用ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)重組蛋白在小鼠體內(nèi)獲得了很高的抗體免疫水平；利用免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察，重組蛋白抗血清對(duì)MDCK細(xì)胞上的流感病毒能夠產(chǎn)生很好的抗原性。 本研究成功構(gòu)建了流感病毒M2d-HA抗原多表位重組蛋白表達(dá)載體，在大腸桿菌中獲得了高效表達(dá)；通過基因工程獲取較高純度的M2d-HA重組蛋白，同時(shí)對(duì)蛋白表達(dá)、純化復(fù)性等實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了初步的探索；在昆明小鼠體內(nèi)，對(duì)該重組蛋白的免疫學(xué)效應(yīng)作了初步的研究，為進(jìn)一步研究廣譜型流感病毒亞單位疫苗提供了很好的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)資料，也為流感病毒亞單位疫苗的開發(fā)及基礎(chǔ)研究奠定了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
[Abstract]:Influenza is a serious respiratory disease caused by influenza virus. Influenza virus (Influenza virus, 鈪

本文編號(hào)：2156862