【摘要】：目的鑒定肺炎鏈球菌中spxB基因編碼蛋白的丙酮酸氧化酶活性、細(xì)胞表達(dá)定位和保守性表達(dá),并初步研究該基因?qū)?xì)菌毒力影響的部分機(jī)制。方法利用PCR方法擴(kuò)增肺炎鏈球菌D39菌株的spxB基因全長序列,并將其整合至表達(dá)載體pET-28a(+),經(jīng)測序鑒定后,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌BL21(DE3),以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)含有His標(biāo)簽的rSpxB蛋白,經(jīng)Ni-NTA親和層析柱純化后,使用SDS-PAGE鑒定蛋白純度,采用一種商品丙酮酸氧化酶活性質(zhì)控方法鑒定其酶活性。以rSpxB蛋白免疫昆明小鼠獲得其多克隆抗體。采用ELISA檢測多克隆抗體效價(jià),采用Western blot鑒定抗體的特異性和蛋白的保守性表達(dá)。采用流式細(xì)胞術(shù)鑒定spxB的細(xì)胞表達(dá)定位。構(gòu)建spxB缺陷菌,通過與流感嗜血桿菌進(jìn)行共同培養(yǎng)初步探索其毒力機(jī)制。結(jié)果實(shí)現(xiàn)了具有丙酮酸氧化酶活性SpxB蛋白的可溶性表達(dá),該蛋白免疫小鼠后獲得高效價(jià)特異的抗SpxB蛋白抗血清,Western blot鑒定顯示SpxB蛋白在1、2、4、6B、14、19F和23F等血清型肺炎鏈球菌均有表達(dá),流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示SpxB蛋白的熒光信號較陰性對照有右移,但較陽性對照的熒光信號弱很多。野生菌株D39產(chǎn)生的過氧化氫顯著高于spxB缺陷菌,D39菌株對流感嗜血桿菌的生長抑制作用顯著強(qiáng)于spxB缺陷菌。結(jié)論肺炎鏈球菌spxB基因編碼的蛋白具有丙酮酸氧化酶活性,在肺炎鏈球菌中有保守表達(dá),且主要表達(dá)于細(xì)胞內(nèi)。該蛋白有助于肺炎鏈球菌與流感嗜血桿菌共同生長時(shí)的優(yōu)勢生長。
[Abstract]:Objective to identify the pyruvate oxidase activity, cellular expression localization and conservative expression of the spxB gene encoding protein in Streptococcus pneumoniae, and to study the mechanism of the effect of the gene on bacterial virulence. Methods the full-length spxB gene of Streptococcus pneumoniae D39 was amplified by PCR. The recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) after being sequenced and integrated into the expression vector pET-28a (),. RSpxB protein with His tag was induced by IPTG. After purification by Ni-NTA affinity chromatography, SDS-PAGE was used to identify the purity of the protein, and a quality control method for the activity of pyruvate oxidase was used to identify its enzyme activity. Kunming mice were immunized with rSpxB protein to obtain their polyclonal antibodies. Polyclonal antibody titers were detected by ELISA and the specificity of antibody and conserved expression of protein were identified by Western blot. Cell expression localization of spxB was identified by flow cytometry. The virulence mechanism of spxB deficient bacteria was studied by co-culture with Haemophilus influenzae. Results the soluble expression of SpxB protein with pyruvate oxidase activity was achieved. After immunizing mice, a high titer specific anti SpxB protein antiserum was obtained. Western blot analysis showed that SpxB protein was expressed in serotypes of Streptococcus pneumoniae, such as 1, 2, 2, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, Flow cytometry showed that the fluorescence signal of SpxB protein shifted to the right compared with the negative control, but much weaker than that of the positive control. The hydrogen peroxide production of wild strain D39 was significantly higher than that of spxB deficient strain D39, which inhibited the growth of Haemophilus influenzae significantly more than that of spxB deficient strain. Conclusion the protein encoded by spxB gene of Streptococcus pneumoniae has pyruvate oxidase activity, conserved expression in Streptococcus pneumoniae, and mainly expressed in cells. This protein contributes to the dominant growth of Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenzae.
【作者單位】： 重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：重慶市自然科學(xué)基金(CSTC 2001BB5137)~~
【分類號】：R378.12

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本文編號：2144859