【摘要】： 第一部分Nogo-A短發(fā)夾樣RNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建 目的構(gòu)建靶向Nogo-A基因的短發(fā)夾樣RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表達(dá)載體。方法根據(jù)Gene bank中提供的Nogo-A基因核苷酸序列,設(shè)計并化學(xué)合成2條shRNA,退火后克隆到pGenesil-1質(zhì)粒的U6啟動子下游從而構(gòu)建重組載體,行限制性內(nèi)切酶酶切和基因測序進(jìn)行鑒定。結(jié)果序列分析結(jié)果表明,兩個重組質(zhì)粒的shRNA編碼序列均成功插入到預(yù)定位置。結(jié)論成功構(gòu)建靶向Nogo-A的shRNA真核表達(dá)載體,為進(jìn)一步研究Nogo-A蛋白的功能及軸突再生抑制的基因治療提供了新的方法。 第二部分短發(fā)夾樣RNA抑制PC12細(xì)胞Nogo-A基因表達(dá)的研究 目的研究Nogo-A shRNA對PC12細(xì)胞Nogo-A基因表達(dá)的抑制作用,為下一步探索Nogo-A的功能奠定基礎(chǔ)。方法經(jīng)脂質(zhì)體2000將前期構(gòu)建的兩個pGenesil-1/Nogo-A shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞,通過熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀觀察EGFP的表達(dá),分別于轉(zhuǎn)染后48h后應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及Western blot法檢測Nogo-A mRNA及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與對照組相比,空載體組的Nogo-A mRNA及蛋白表達(dá)水平無顯著性差異(p0.05),而轉(zhuǎn)染pGenesil-1-/Nogo-A組的Nogo-A mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯下降(p0.05)。結(jié)論構(gòu)建的pGenesil-1-/Nogo-A shRNA重組質(zhì)粒能有效抑制Nogo-A基因在PC12細(xì)胞的表達(dá)。 第三部分RNA干擾抑制Nogo-A基因表達(dá)對PC12細(xì)胞多巴胺釋放的影響 目的研究抑制Nogo-A基因表達(dá)對PC12細(xì)胞多巴胺釋放的影響,探討Nogo-A在神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞表達(dá)的意義。方法經(jīng)脂質(zhì)體將Nogo-A shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到PC12細(xì)胞,分別于轉(zhuǎn)染后24h、48h采用高效液相色譜儀(high performance liquid chromatography, HPLC)檢測不同處理組細(xì)胞的多巴胺釋放量。結(jié)果與對照組相比,轉(zhuǎn)染48h后Nogo-A shRNA組細(xì)胞多巴胺釋放量明顯減少(P0.05),而轉(zhuǎn)染空載體組多巴胺釋放量無明顯變化(P0.05)。結(jié)論Nogo-A基因沉默可以抑制PC12細(xì)胞多巴胺的釋放,Nogo-A可能參與多巴胺的釋放調(diào)節(jié)。 第四部分RNA干擾抑制Nogo-A基因表達(dá)對PC12細(xì)胞凋亡的影響 目的研究Nogo-A基因沉默對PC12細(xì)胞凋亡的影響。方法應(yīng)用脂質(zhì)體將Nogo-A shRNA真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到PC12細(xì)胞,在轉(zhuǎn)染后不同時間應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測細(xì)胞增殖活性,原位末端標(biāo)記(TUNEL)法及流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果與對照組相比,Nogo-A siRNA處理組細(xì)胞的增殖活性明顯增加(P0.05),凋亡率明顯下降(P0.05)。結(jié)論Nogo-A基因可能與腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。
[Abstract]:Part I: construction of Nogo-A short hairpin RNA eukaryotic expression vector objective to construct a short hairpin RNA (short hairpin RNA-shRNA-targeting eukaryotic expression vector targeting Nogo-A gene. Methods according to the nucleotide sequence of Nogo-A gene provided in Gene bank, two shRNAs were designed and chemically synthesized. After annealing, two shRNAs were cloned into the downstream of U6 promoter of pGenesil-1 plasmid to construct recombinant vector. Restriction endonuclease digestion and gene sequencing were performed to identify the recombinant vector. Results the sequence analysis showed that the shRNA coding sequences of the two recombinant plasmids were successfully inserted into the predetermined position. Conclusion the successful construction of shRNA eukaryotic expression vector targeting Nogo-A provides a new method for further study of the function of Nogo-A protein and gene therapy of axon regeneration inhibition. The second part: short hairpin RNA inhibits the expression of Nogo-A gene in PC12 cells objective to study the inhibitory effect of Nogo-A shRNA on Nogo-A gene expression in PC12 cells and to lay a foundation for further exploring the function of Nogo-A. Methods two previously constructed pGenesil-1/Nogo-A shRNA plasmids were transfected into PC12 cells by liposome 2000. The expression of EGFP was observed by fluorescence microscope and flow cytometry. The expression of Nogo-A mRNA and protein were detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blot after 48 hours of transfection. Results compared with the control group, the expression of Nogo-A mRNA and protein in the empty vector group was not significantly different (p0.05), but the expression level of Nogo-A mRNA and protein in the transfected pGenesil-1-/Nogo-A group was significantly decreased (p0.05). Conclusion the constructed pGenesil-1-/Nogo-A shRNA recombinant plasmid can effectively inhibit the expression of Nogo-A gene in PC12 cells. The effect of RNA interference on dopamine release in PC12 cells objective to study the effect of inhibiting Nogo-A gene expression on dopamine release in PC12 cells and to explore the significance of Nogo-A expression in neuroendocrine cells. Methods the eukaryotic expression plasmid of Nogo-A shRNA was transfected into PC12 cells by liposome. The dopamine release was detected by high performance liquid chromatograph (high performance liquid chromatography, HPLC) at 24 h and 48 h after transfection. Results compared with the control group, the dopamine release of Nogo-A shRNA group decreased significantly (P0.05) after 48 h transfection, but the dopamine release of empty vector group did not change significantly (P0.05). Conclusion Nogo-A gene silencing can inhibit the release of dopamine in PC12 cells. Nogo-A may be involved in the regulation of dopamine release. The effect of RNA interference on the apoptosis of PC12 cells by inhibiting the expression of Nogo-A Gene objective to study the effect of Nogo-A gene silencing on the apoptosis of PC12 cells. Methods Nogo-A shRNA eukaryotic expression vector was transfected into PC12 cells by liposome. The cell proliferation activity was detected by tetramethylazolium (MTT) method at different times after transfection, and the apoptosis rate was detected by in situ end labeling (TUNEL) assay and flow cytometry. Results compared with the control group, the proliferation activity of the cells treated with Nogo-A siRNA was significantly increased (P0.05), and the apoptosis rate was significantly decreased (P0.05). Conclusion Nogo-A gene may be related to apoptosis of tumor cells.
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R651;R346

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本文編號：2144401