【摘要】：TNF 家族的B 淋巴細(xì)胞活化因子(B cell activating factor belonging to the TNF family,BAFF)是腫瘤壞死因子(TNF)超家族的一個(gè)新成員,它屬Ⅱ型跨膜蛋白,通過與其受體結(jié)合而廣泛參與B 細(xì)胞增殖分化及抗體的產(chǎn)生;同時(shí)也參與T 細(xì)胞的活化與應(yīng)答過程,在體液免疫和細(xì)胞免疫中具有重要作用。研究證實(shí)BAFF 過表達(dá)密切參與了多種自身免疫性疾病和某些腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。因此,BAFF 及其受體有望成為治療相關(guān)性疾病時(shí)進(jìn)行藥物設(shè)計(jì)的新靶點(diǎn)。為此我們克隆了編碼人BAFF 胞外區(qū)134-285氨基酸殘基(即可溶性BAFF,sBAFF)及其突變體cDNA,構(gòu)建了相應(yīng)重組表達(dá)質(zhì)粒,表達(dá)并純化了sBAFF 及其突變體蛋白,最后對sBAFF 及其突變體蛋白的功能活性進(jìn)行了鑒定。所取得的主要研究結(jié)果如下: 1.經(jīng)RT-PCR 成功地克隆了sBAFF cDNA。測序后經(jīng)查對,與GenBank 上登錄的編碼相應(yīng)sBAFF cDNA 的序列完全一致。 2.以pUC19/sBAFF 為模板,經(jīng)一步反向PCR 構(gòu)建sBAFF 的突變體cDNA,使BAFF 217-224 位的八個(gè)氨基酸(VHVFGDEL)的編碼序列被GG,SS,SG 和GS 的編碼序列所取代。 3.將測序正確的野生型和突變體目的片段插入原核表達(dá)質(zhì)粒pQE-80L,成功地構(gòu)建了重組原核表達(dá)質(zhì)粒pQE-80L/sBAFF,pQE-80L/GG,pQE-80L/SS,pQE-80L/SG 及pQE-80L/GS。 4.上述質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,經(jīng)IPTG 誘導(dǎo),均獲得了較高水平的表達(dá)。SDS-PAGE 和Western blot 分析表明,重組sBAFF 蛋白主要位于包涵體中,分子量約為20kDa;而四個(gè)突變體蛋白則在包涵體和胞漿中均有表達(dá),且在胞漿中表達(dá)占優(yōu)勢,分子量約為19kDa。確立了目的蛋白在大腸桿菌中高效表達(dá)的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為終濃度0.5mmol/L 的IPTG 在37℃誘導(dǎo)表達(dá)4 小時(shí)。 5.sBAFF 蛋白經(jīng)Ni2+-NTA 純化系統(tǒng)及尿素分步透析,得到了有效純化和復(fù)性,復(fù)性蛋白經(jīng)Sephadex G75 柱分析顯示,以單體和三聚體兩種形式存在。四個(gè)突變體蛋白在天然狀態(tài)下經(jīng)Ni2+-NTA 純化系統(tǒng)和PBS 透析后也得到了有效純化。純化蛋白在SDS-PAGE 上均呈現(xiàn)單一條帶。
[Abstract]:TNF- family B cell activating factor belonging to the family (BAFF) is a new member of the tumor necrosis factor (TNF-) superfamily. It belongs to type 鈪，

本文編號：2138834