【摘要】：目的:克隆人工IL-17F基因,在大腸桿菌中重組表達并構(gòu)建人IL-17F轉(zhuǎn)基因細胞和真核穩(wěn)定表達,研究其生物學活性。 方法:分離人外周血單個核細胞,經(jīng)PHA刺激后,提取細胞總RNA,根據(jù)GenBank公布的人IL-17F cDNA序列設計并合成一對引物,采用RT-PCR技術克隆人IL-17F基因,將其亞克隆到pUCm-T載體并鑒定。以測序正確的pUCm-T/hIL-17F為模板,PCR擴增出目的基因片段,并分別正向插入原核表達載體pGEX-5X-3和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pSIV-1,構(gòu)建重組表達載體pGEX-5X-3/hIL-17F和pSIV-1/hIL-17F。重組原核表達載體pGEX-5X-3/hIL-17F導入大腸桿菌BL21并經(jīng)IPTG誘導表達包涵體融合蛋白,純化后進行Western印跡鑒定。MTT法分析GST-hIL-17F純品蛋白對人臍靜脈內(nèi)皮細胞ECV304的生長抑制作用和ELISA法檢測其對ECV304內(nèi)皮細胞表達IL-6、IFN_γ和TNF-α的生物學作用,并采用雞胚絨毛尿囊膜(CAM)法分析其對血管形成的影響。重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pSIV-1/hIL-17F與輔助病毒載體pHIT456和pHIT60混合后,脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染包裝細胞293T細胞。獲得的具有感染能力的成熟重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染SMMC-7721肝癌細胞,經(jīng)G418加壓篩選獲得抗性細胞株,并RT-PCR、Western blot檢測目的基因的轉(zhuǎn)錄和表達。
[Abstract]:Aim: to clone the artificial IL-17F gene and express it in Escherichia coli and construct human IL-17F transgenic cells and eukaryotic cells to study its biological activity. Methods: human peripheral blood mononuclear cells were isolated and stimulated by PHA, the total RNAs were extracted. A pair of primers were designed and synthesized according to the cDNA sequence of human IL-17F published by GenBank. The human IL-17F gene was cloned by RT-PCR, subcloned into pUCm-T vector and identified. The target gene fragment was amplified by PCR using the correctly sequenced pUCm-Tr / hIL-17F, and was inserted into prokaryotic expression vector pGEX-5X-3 and retrovirus vector pSIV-1, respectively. The recombinant expression vectors pGEX-5X-3 / hIL-17F and pSIV-1 / hIL-17F were constructed. Recombinant prokaryotic expression vector pGEX-5X-3 / hIL-17F was introduced into Escherichia coli BL21 and induced by IPTG to express inclusion body fusion protein. After purification, the growth inhibition of GST-hIL-17F protein on human umbilical vein endothelial cells (ECV304) and the biological effects of GST-hIL-17F protein on the expression of IL-6, IFN- 緯 and TNF- 偽 in ECV304 endothelial cells were detected by Western blotting. The effect of chorioallantoic membrane (CAM) on angiogenesis was analyzed. The recombinant retroviral vector pSIV-1 / hIL-17F was mixed with the auxiliary virus vector pHIT456 and pHIT60, and then co-transfected into 293T cells by liposome method. SMMC-7721 hepatoma cell line was infected with mature recombinant retrovirus. The resistant cell line was obtained by G418 pressurization screening, and the transcription and expression of the target gene were detected by RT-PCRG Western blot.
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2005
【分類號】：R392

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