本文選題：EGFP + DsRed��； 參考：《華中科技大學》2006年碩士論文

【摘要】： 腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α)主要由活化的T細胞、單核/巨噬細胞、NK細胞產(chǎn)生并分泌,具有多種不同的生物學功能。它以兩種生物活性形式存在,即26kD的跨膜型TNF-α(transmembran TNF-α,TM-TNF-α)和17kD的分泌型TNF-α(secreted TNF-α, S-TNF-α)。TM-TNF-α是S-TNF-α的前體,在TNF-α轉(zhuǎn)換酶(TACE)的作用下,其胞外段被切割,脫落成S-TNF-α。 近年來研究發(fā)現(xiàn),TM-TNF-α和其受體結(jié)合后,不僅可以啟動受體后的信號傳導,即正向信號,而且能向自身所在的細胞傳遞信號,即“反向信號”(reverse signaling),并引起相應的生物學效應。 本室的前期實驗通過免疫共沉淀技術(shù)證實IKK-α和TRAF1分別可以與TM-TNF-α共沉淀下來,提示這兩種信號分子有可能以直接或間接的方式與TM-TNF-α的胞漿段結(jié)合,傳遞反向信號。 本實驗主要通過基因工程技術(shù)從細胞中獲取IKK-α和TRAF1全長編碼基因,分別與可以發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的熒光蛋白對構(gòu)建成融合蛋白,同時構(gòu)建熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測用的陽性質(zhì)粒,為通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)進一步研究它們在活體細胞內(nèi)相互之間的作用奠定基礎。本研究主要結(jié)果如下: 一. IKK-α-pEGFP、TRAF1-pDsRed、EGFP-pDsRed構(gòu)建、克隆及鑒定 1.重組體的構(gòu)建和克隆:提取Raji細胞總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄,以cDNA為模板,用PCR擴增IKK-α和TRAF1目的基因;通過巢式PCR進行鑒定,以確認擴增片段的特異性。同時以pIRES-EGFP質(zhì)粒為模板,經(jīng)PCR擴增得到EGFP目的基因片斷。以Xho I和EcoR I雙酶切pEGFP-N3質(zhì)粒和IKK-α目的基因,以EcoR I和SacII雙酶切pDsRed-N1質(zhì)粒和TRAF1及EGFP目的基因,并用T4 DNA連接酶連接,獲得IKK-α-pEGFP、TRAF1-pDsRed及EGFP-pDsRed的重組體,然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細菌,挑選陽性克隆。 2.陽性克隆的鑒定:以菌落PCR初步篩選陽性克隆,再用上述限制性內(nèi)切酶雙酶切鑒定,結(jié)果顯示三種重組體經(jīng)酶切分別能得到2.2Kb、1.3Kb和720bp的目的片斷,與連接的目的基因大小一致。進一步DNA測序分析,證實三個重組體均各包含IKK-α、TRAF1和EGFP的編碼區(qū),沒有突變和移碼。提示IKK-α-pEGFP、TRAF1-pDsRed及EGFP-pDsRed三個重組體已經(jīng)構(gòu)建成功。 二. IKK-α-pEGFP、TRAF1-pDsRed、EGFP-pDsRed三個重組體在真核細胞表達與鑒定 將三種重組體分別轉(zhuǎn)染COS7細胞,可見IKK-α-pEGFP融合蛋白(綠色熒光)彌散分布在胞漿內(nèi),TRAF1-pDsRed融合蛋白(紅色熒光)則局限在細胞亞區(qū)。而表達EGFP-pDsRed融合蛋白既能呈現(xiàn)綠色熒光,又可呈現(xiàn)紅色熒光,主要分布在胞漿內(nèi)。提示IKK-α-pEGFP、TRAF1-pDsRed、EGFP-pDsRed三種融合蛋白均在真核細胞中被成功表達。 本實驗成功地構(gòu)建了IKK-α-pEGFP、TRAF1-pDsRed、EGFP-pDsRed三種重組體,且在真核細胞中得到表達,并證實IKK-α和TRAF1兩種分子的胞內(nèi)定位。為進一步用FRET技術(shù)研究兩分子間及與TM-TNF-α胞內(nèi)段之間的相互作用奠定基礎。EGFP-pDsRed陽性質(zhì)粒的構(gòu)建也為FRET檢測提供陽性參照。
[Abstract]:Tumor necrosis factor - alpha (tumor necrosis factor- alpha) is mainly produced and secreted by activated T cells, mononuclear / macrophages and NK cells. It has a variety of different biological functions. It exists in two forms of biological activity, namely, 26kD's transmembrane TNF- alpha (transmembran TNF- a, TM-TNF- a) and 17kD secretory alpha alpha (alpha). .TM-TNF- alpha is a precursor of S-TNF- alpha. Under the action of TNF- alpha converting enzyme (TACE), its extracellular segment is cut off and shedding into S-TNF- alpha.
In recent years, it has been found that the binding of TM-TNF- alpha to its receptor can not only initiate the signal transduction after the receptor, namely the positive signal, but also transmit the signal to the cell in its own, that is the "reverse signaling", and causes the corresponding biological effects.
The previous experiments in the laboratory confirmed that IKK- alpha and TRAF1 could be co precipitated with TM-TNF- alpha by immunoprecipitation technique, suggesting that these two signal molecules may be combined with the cytoplasm of TM-TNF- alpha in a direct or indirect way and transmit the reverse signal.
In this experiment, IKK- alpha and TRAF1 full-length encoding genes were obtained from the cells by genetic engineering technology, and the fusion protein was constructed with fluorescence resonance energy transfer (FRET) fluorescent protein, respectively, and the positive plasmids used for fluorescence resonance energy transfer detection were constructed, which was further studied by fluorescence resonance energy transfer technology. The results are as follows:
Construction, cloning and identification of IKK- alpha -pEGFP, TRAF1-pDsRed and EGFP-pDsRed
1. the construction and cloning of the recombinant: extracting the total RNA of Raji cells for reverse transcription, using cDNA as the template, amplification of IKK- alpha and TRAF1 target genes with PCR, identification by nested PCR to confirm the specificity of the amplified fragment. At the same time, pIRES-EGFP plasmid was used as a template to amplify the fragment of EGFP target gene. The grain and IKK- alpha target genes, using EcoR I and SacII double enzymes to cut pDsRed-N1 plasmids and TRAF1 and EGFP target genes, were linked with T4 DNA ligase, and IKK- alpha -pEGFP, TRAF1-pDsRed and recombinant plasmid were obtained. Then the joint products were transformed into alpha receptive bacteria to select positive clon.
2. identification of positive clones: screening positive clones with colony PCR and using the restriction endonuclease double enzyme to identify the positive clones. The results showed that three kinds of recombinant bodies were able to obtain the target fragments of 2.2Kb, 1.3Kb and 720bp by enzyme cut, and the size of the linked target genes. Further DNA sequencing analysis showed that all three recombinant bodies contained IKK- a, TRAF each. The coding regions of 1 and EGFP showed no mutation and frameshift, suggesting that IKK-, -pEGFP, TRAF1-pDsRed and EGFP-pDsRed three recombinants have been successfully constructed.
Two. Expression and identification of three recombinants of IKK- alpha -pEGFP, TRAF1-pDsRed and EGFP-pDsRed in eukaryotic cells
The three recombinant proteins were transfected into COS7 cells respectively. It was found that the IKK- alpha -pEGFP fusion protein (green fluorescence) was dispersed in the cytoplasm, and the TRAF1-pDsRed fusion protein (red fluorescence) was localized in the cell subregion. The expression of EGFP-pDsRed fusion protein could present both green fluorescence and red fluorescence, mainly in the cytoplasm. It indicated that IKK- alpha -pEGFP, The three fusion proteins of TRAF1-pDsRed and EGFP-pDsRed were successfully expressed in eukaryotic cells.
In this experiment, three recombinant IKK- alpha -pEGFP, TRAF1-pDsRed, EGFP-pDsRed were successfully constructed and expressed in eukaryotic cells, and the intracellular localization of the two molecules of IKK- A and TRAF1 was confirmed. The construction of the basis for the further study of the interaction between the two molecules and the interaction between the two molecules and the intracellular segments of TM-TNF- alpha was constructed by FRET technology. It also provides positive reference for FRET detection.
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2006
【分類號】：R392

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本文編號：2111935