本文選題：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 + 心肌細(xì)胞��； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2005年碩士論文

【摘要】：背景:隨著干細(xì)胞移植治療心臟疾病的研究不斷深入,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs)由于具有易獲得、易擴(kuò)增、幾乎無移植物抗宿主反應(yīng)、無倫理道德限制等優(yōu)點,成為目前研究的熱點。體外誘導(dǎo)和體內(nèi)移植方面均取得了令人鼓舞的成就[1-3],本課題組前期研究發(fā)現(xiàn):BMMSCs 體外經(jīng) 5-氮雜胞苷(5-azacytidine,5-aza)誘導(dǎo)后能表達(dá)心臟發(fā)育早期轉(zhuǎn)錄因子 GATA4,NKx2.5,骨骼肌增強(qiáng)因子-2C和轉(zhuǎn)化生長因子-β等[2]; BMMSCs移植入心肌病模型鼠體內(nèi),病鼠心功能明顯改善 。但在對 BMMSCs 移植后心功 [3]能改善的機(jī)理探討中還存在很大的爭議,爭議的焦點在于移植后的BMMSCs 能否分化成具有正常心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)并具備主動收縮功能的細(xì)胞。由于無法直接在宿主心肌內(nèi)觀察移植細(xì)胞的收縮,就現(xiàn)階段的技術(shù)水平而言,只有從側(cè)面去間接說明這一點。即建立體外誘導(dǎo)模型,阻斷心肌特異結(jié)構(gòu)蛋白肌聯(lián)蛋白 titin 基因的表達(dá),以此來觀察誘導(dǎo)后的BMMSCs是否還能分化成具有相應(yīng)結(jié)構(gòu)及具有收縮功能的心肌樣細(xì)胞。 目的:構(gòu)建能干擾正常心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白 titin 的重組質(zhì)粒,將其轉(zhuǎn)染入經(jīng) 5-aza 誘導(dǎo)后的 BMMSCs,觀察 BMMSCs 能否進(jìn)一步分化成心 重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 4 肌樣細(xì)胞并表達(dá) titin、肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain, MHC)、 肌動蛋白 actin、心肌肌鈣蛋白 T(cardiac troponin T,cTnT)等心肌 特異蛋白標(biāo)志物,同時就 titin 在心肌結(jié)構(gòu)蛋白發(fā)育和肌小節(jié)組裝過 程中所起的作用進(jìn)行初步探討。 材料和方法: 1. 分別構(gòu)建攜帶針對 Wistar 大鼠 titinN2B 區(qū)設(shè)計的 siRNA 重組 質(zhì)粒 pSITITIN 和攜帶針對人β-actin 設(shè)計的 siRNA 重組質(zhì)粒 pSIACTIN,利用脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)染入體外分離培養(yǎng) 1w 的正常新生 Wistar 大鼠心肌細(xì)胞中,免疫熒光檢測 titin 的表達(dá)情況。 2. 將上述重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入經(jīng) 5-aza 誘導(dǎo)后 2w 的 BMMSCs,免 疫熒光檢測 titin 的表達(dá)情況。 3. 免疫熒光檢測 titin 被阻斷后 MHC、actin、cTnT 的表達(dá)情況 。 結(jié)果: 1. 酶切和 DNA 序列測定證實重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。 2. 重組質(zhì)粒 pSITITIN 轉(zhuǎn)染入正常新生鼠心肌細(xì)胞后,titin 的表 達(dá)減弱(P0.001)。而對照 pSIACTIN 轉(zhuǎn)染入正常新生鼠心肌細(xì)胞后, titin 的表達(dá)無明顯變化(P0.05)。 3. 重組質(zhì)粒 pSITITIN 轉(zhuǎn)染入經(jīng) 5-aza 誘導(dǎo)后 2w 的 BMMSCs 后, titin 的表達(dá)減弱。而對照 pSIACTIN 轉(zhuǎn)染入經(jīng) 5-aza 誘導(dǎo)后 2w 的 BMMSCs 后,titin 的表達(dá)無明顯變化。titin 的表達(dá)被阻斷后,MHC、 actin 的表達(dá)無明顯變化,cTnT 的表達(dá)減弱。 結(jié)論:
[Abstract]:Background: with the development of stem cell transplantation in the treatment of heart disease, bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSCs) have the advantages of easy to obtain, easy to expand, almost no graft versus host reaction, no ethical restrictions and so on. It has become the hot spot of current research. Encouraging achievements have been made in both in vitro induction and in vivo transplantation [1-3]. Our previous studies have found that in vitro, 5 azacytidine 5-aza can express GATA4NKx2.5, skeletal muscle enhancer factor -2C, a transcription factor GATA4NKx2.5and skeletal muscle enhancer factor -2C, after induction by 5-azacytidineine 5-aza in vitro. And transforming growth factor- 尾 [2]; BMMSCs were transplanted into cardiomyopathy model mice, The heart function of the diseased rats was improved obviously. However, there is still a lot of controversy on the mechanism of cardiac function [3] improvement after BMMSCs transplantation, the focus of which is whether BMMSCs can differentiate into cells with normal cardiomyocyte structure and active contractile function. Since it is not possible to observe the contraction of transplanted cells directly in the host myocardium, this can only be explained indirectly from the side in view of the present technical level. That is to establish an in vitro induction model to block the expression of myocyte specific structural protein (titin) gene in order to observe whether the induced BMMSCs can also differentiate into cardiomyoid cells with corresponding structure and contractile function. Objective: to construct a recombinant plasmid that interferes with the structural protein titin of normal cardiomyocytes. The BMMSCs were transfected into BMMSCs induced by 5-aza, and the differentiation of BMMSCs into a master's degree thesis of Chongqing Medical University was observed. 4 myoid cells expressed titin, myosin heavy chain (myosin heavy chain, MHC, actin actinin, Cardiac troponin T (cardiac troponin TnT) and other myocardial specific protein markers, At the same time, the role of titin in the development of myocardial structural protein and the assembly process of muscle section was discussed. Materials and methods: 1. Construction of siRNA recombinant plasmid pSITIN designed for titinN2B region of Wistar rat and siRNA recombinant plasmid designed for human 尾 -actin PSIACTIN was transfected with liposome into normal neonatal Wistar rat cardiomyocytes cultured for 1 week in vitro. Immunofluorescence detection of titin expression. 2. The recombinant plasmids were transfected into BMMSCs at 2 weeks after induction by 5-aza, and the expression of titin was detected by immunofluorescence. Immunofluorescence was used to detect the expression of cTnT after titin was blocked. Results: 1. Restriction endonuclease digestion and DNA sequencing confirmed that the recombinant plasmid was successfully constructed. After transfection of recombinant plasmid pSITITIN into normal neonatal rat cardiomyocytes, the expression of titin was weakened (P0.001). The expression of titin did not change significantly after transfection of control pSIACTIN into normal neonatal rat cardiomyocytes (P0.05). The expression of titin decreased after transfection of recombinant plasmid pSITITIN into BMMSCs at 2 weeks after induction by 5-aza. However, there was no significant change in the expression of titin after transfection of pSIACTIN into BMMSCs at 2 weeks after transfection with pSIACTIN, and the expression of titin was blocked after the transfection of pSIACTIN into BMMSCs. There was no significant change in the expression of actin and the expression of cTnT was decreased. Conclusion:
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號】：R329

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5 丁e醵，

本文編號：2109430