本文選題：巨噬細(xì)胞抑制因子-1(MIC-1) + 畢赤酵母��； 參考：《中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)》2007年碩士論文

【摘要】： 目的：構(gòu)建人巨噬細(xì)胞抑制因子-1(MIC-1)優(yōu)化密碼子的表達(dá)載體，篩選穩(wěn)定的高表達(dá)MIC-1的酵母菌株，探索MIC-1重組蛋白的純化條件，并制備抗MIC-1多克隆抗體，為胰腺癌血清診斷試劑的研制奠定基礎(chǔ)。 方法：通過(guò)RT-PCR及基因克隆技術(shù)自人胎盤(pán)組織中獲得MIC-1 cDNA的全基因片段；通過(guò)PCR技術(shù)將MIC-1 cDNA基因片段5’端的7個(gè)畢赤酵母非偏好密碼子定點(diǎn)突變?yōu)槠渫x優(yōu)越密碼子；構(gòu)建pPIC9K-mtMIC-1表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染并在畢赤酵母GS115工程菌中表達(dá)MIC-1重組蛋白，通過(guò)G418抗性篩選穩(wěn)定的MIC-1高表達(dá)菌株；研究不同表達(dá)條件對(duì)MIC-1重組蛋白表達(dá)量的影響；研究和初步建立MIC-1重組蛋白的純化方案及工藝；以純化的重組MIC-1蛋白為抗原免疫新西蘭白兔，制備抗MIC-1的多克隆抗體。 結(jié)果：成功克隆MIC-1 cDNA，并構(gòu)建優(yōu)化密碼子的MIC-1重組蛋白表達(dá)載體；獲得穩(wěn)定的高表達(dá)重組蛋白畢赤酵母菌株，表達(dá)量約為30～50mg／L；初步建立了MIC-1重組蛋白中試發(fā)酵工藝；建立較完整的MIC-1重組蛋白的分離純化體系，純化所得重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)純度達(dá)90％以上；獲得抗MIC-1重組蛋白的多克隆抗血清，抗體效價(jià)為1：128，，000。 結(jié)論：通過(guò)優(yōu)化密碼子的MIC-1重組蛋白表達(dá)載體，重組MIC-1畢赤酵母菌株的表達(dá)量顯著高于國(guó)際上其他單位該蛋白的表達(dá)水平；優(yōu)化了發(fā)酵、表達(dá)和純化工藝，重組蛋白純度達(dá)90％以上；以純化蛋白為抗原獲得了高效價(jià)的抗MIC-1多克隆抗體。該項(xiàng)研究為MIC-1蛋白的功能研究及其抗體的臨床診斷試劑研制奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective: to construct an optimized codon expression vector of human macrophage inhibitory factor 1 (MIC-1), screen stable yeast strain with high expression of MIC-1, explore the purification conditions of MIC-1 recombinant protein, and prepare anti-MIC-1 polyclonal antibody. To lay a foundation for the development of serum diagnostic reagent for pancreatic cancer. Methods: the whole gene fragment of MIC-1 cDNA was obtained from human placenta by RT-PCR and gene cloning, and 7 Pichia pastoris nonpreferred codon at the 5'end of MIC-1 cDNA fragment were mutated to its synonymous superior codon by PCR. PPIC9K-mtMIC-1 expression vector was constructed and transfected into Pichia pastoris GS115 to express MIC-1 recombinant protein. The stable MIC-1 high expression strain was screened by G418 resistance, and the effect of different expression conditions on the expression of MIC-1 recombinant protein was studied. The purified recombinant MIC-1 protein was used as antigen to immunize New Zealand white rabbits to prepare polyclonal antibodies against MIC-1. Results: MIC-1 cDNAwas cloned successfully and the MIC-1 recombinant protein expression vector with optimized codon was constructed, and a stable recombinant protein Pichia pastoris strain was obtained, which expressed about 30 mg / L, and a pilot fermentation process of MIC-1 recombinant protein was established. A complete purification system of MIC-1 recombinant protein was established. The purity of the purified recombinant protein was over 90% by SDS-PAGE, and the polyclonal antiserum of anti-MIC-1 recombinant protein was obtained with a titer of 1: 128000. Conclusion: the expression level of MIC-1 recombinant protein in Pichia pastoris strain was significantly higher than that of other units in the world, and the fermentation, expression and purification techniques were optimized. The purity of recombinant protein was more than 90%, and the purified protein was used as antigen to obtain a high titer polyclonal antibody against MIC-1. This study laid a foundation for the study of the function of MIC-1 protein and the development of clinical diagnostic reagent for antibodies.
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類(lèi)號(hào)】：R392;Q78

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本文編號(hào)：2103105