本文選題：細(xì)胞芯片 + 免疫分型�。� 參考：《中國(guó)醫(yī)科大學(xué)》2007年碩士論文

【摘要】： 目的 白血病是導(dǎo)致惡性腫瘤死亡的主要疾病之一，其中急性白血病占35歲以下成人腫瘤死亡首位。在發(fā)病率最高的西歐、北美地區(qū)白種人中白血病年死亡率為3.2～7.4/10萬(wàn)人口；發(fā)病率低的亞洲、南美洲地區(qū)年死亡率為2.8～4.5/10萬(wàn)人口。我國(guó)年發(fā)病率與死亡率為2～4/10萬(wàn)人口，，與歐美等國(guó)的類(lèi)型分布有較明顯的差別。在白血病的診療中，對(duì)白血病進(jìn)行分型成為關(guān)鍵，不同類(lèi)型的白血病其診療方案不同，療效及預(yù)后也不同。80年代以前白血病的分型主要參照FAB分型標(biāo)準(zhǔn)。隨著CD抗原不斷被國(guó)際協(xié)作組確認(rèn)，MICM分型已成為當(dāng)今白血病診斷分型、預(yù)后判斷和殘留病變檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)。目前臨床上進(jìn)行白血病的免疫分型主要是應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)及免疫組化技術(shù)，其分型受到標(biāo)本量、價(jià)格、程序等的限制，而且一次實(shí)驗(yàn)只能分析1～4個(gè)表面抗原，漏掉了大量監(jiān)測(cè)機(jī)體免疫狀態(tài)的表面抗原指標(biāo)。隨著生物芯片技術(shù)的發(fā)展，學(xué)者們開(kāi)始應(yīng)用這種高通量、并行性、集成化的技術(shù)平臺(tái)進(jìn)行白血病的免疫分型研究。本實(shí)驗(yàn)是在前人的基礎(chǔ)上對(duì)應(yīng)用于急性白血病免疫分型診斷的細(xì)胞芯片進(jìn)行深入研究，摸索其最佳點(diǎn)樣條件、最佳孵育條件及穩(wěn)定性，并用完善后的細(xì)胞芯片對(duì)白血病患者外周血標(biāo)本進(jìn)行免疫學(xué)分型，旨在為臨床診斷和抗體靶向治療提供快速、簡(jiǎn)便、完整的免疫學(xué)資料。 材料與方法 1、材料 (1)實(shí)驗(yàn)標(biāo)本：醫(yī)大一院化驗(yàn)室白血病患者外周血(幼稚細(xì)胞數(shù)30％)及健康志愿者外周血。 (2)試劑及主要儀器：CD抗體，熒光標(biāo)記一抗、二抗，免疫組織化學(xué)試劑盒等。主要儀器：生物芯片點(diǎn)樣儀、激光共聚焦掃描儀、低溫離心機(jī)、CCD圖像分析系統(tǒng)。 2、方法 (1)最佳點(diǎn)樣條件的確定 摸索不同濃度的單克隆CD抗體，制成細(xì)胞芯片以確定最佳點(diǎn)樣條件。 (2)最佳孵育條件的確定 ①最佳標(biāo)本細(xì)胞濃度的確定：摸索不同細(xì)胞濃度對(duì)細(xì)胞芯片的影響，以確定最佳。 ②最佳孵育時(shí)間的確定：摸索不同孵育時(shí)間對(duì)細(xì)胞芯片的影響，以確定最佳。 ③最佳孵育溫度的確定：摸索不同孵育溫度對(duì)細(xì)胞芯片的影響，以確定最佳。 3、穩(wěn)定性試驗(yàn) 加速實(shí)驗(yàn)和周期為12個(gè)月的長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)。 4、臨床標(biāo)本的免疫學(xué)分型 對(duì)72例臨床白血病標(biāo)本進(jìn)行免疫學(xué)分型并驗(yàn)證結(jié)果。 結(jié)果 1、最佳點(diǎn)樣條件 在單克隆CD抗體稀釋濃度為50μg/mL時(shí)，信號(hào)達(dá)到飽和，信噪比最高；25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL點(diǎn)陣信號(hào)強(qiáng)度逐漸減弱，信噪比逐漸減低。 2、最佳孵育條件 在室溫條件下(20℃)，標(biāo)本細(xì)胞懸液(5×10~6/mL)與細(xì)胞芯片孵育45min，點(diǎn)陣捕獲細(xì)胞信噪比最高，點(diǎn)陣結(jié)合細(xì)胞特異性最好。 3、穩(wěn)定性 三批芯片(050630、050718、050801)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果： (1)三批芯片在溫度為(25.0±0.5)℃，相對(duì)濕度60％±5％的條件下貯存6個(gè)月，各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞芯片表觀性質(zhì)無(wú)變化，捕獲細(xì)胞能力良好。 (2)三批芯片在-20℃冰箱中貯存12個(gè)月，各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞芯片表觀性質(zhì)無(wú)變化，捕獲細(xì)胞能力良好。 (3)三批芯片在溫度為(4.0±0.5)℃，相對(duì)濕度75％±5％的條件下貯存12個(gè)月，各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞芯片表觀性質(zhì)無(wú)變化，捕獲細(xì)胞能力良好。 4、臨床標(biāo)本的免疫學(xué)分型 72例臨床標(biāo)本的免疫學(xué)分型結(jié)果：14例B-ALL：14例表達(dá)CD19和HLA-DR，5例表達(dá)CD20，5例表達(dá)CD22，8例表達(dá)CD79b，9例表達(dá)CD10，1例表達(dá)CD34；12例T-ALL：8例表達(dá)CD2，12例表達(dá)CD7，10例表達(dá)TCRαβ或TCRγδ，HLA-DR均不表達(dá)；46例AML(ANLL)：46例均表達(dá)CD33，30例表達(dá)CD13，22例表達(dá)CD15，14例表達(dá)CD11b和CD14，1例表達(dá)CD235a，1例表達(dá)CD4而不表達(dá)CD2，23例表達(dá)HLA-DR。 結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)采用濃度為50μg/mL的單克隆CD抗體制備的細(xì)胞芯片，于室溫條件下(20℃)與標(biāo)本細(xì)胞懸液(5×10~6/mL)孵育45min效果最好。此細(xì)胞芯片采用耐熱加速實(shí)驗(yàn)法6個(gè)月穩(wěn)定；耐低溫加速實(shí)驗(yàn)法12個(gè)月穩(wěn)定；長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)法12個(gè)月穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)說(shuō)明細(xì)胞芯片在穩(wěn)定性方面符合國(guó)際化規(guī)范。本實(shí)驗(yàn)所得的免疫分型結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的白血病免疫分型結(jié)果一致，可作為臨床白血病免疫學(xué)分型及抗體靶向治療的依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)室研制的細(xì)胞芯片重復(fù)性和穩(wěn)定性好，為臨床白血病免疫分型提供了一種更快速簡(jiǎn)便、高通量、并行性、集成化的技術(shù)平臺(tái)。
[Abstract]:Purpose






Leukemia is one of the main diseases leading to malignant tumor death , in which acute leukemia is the first in the adult tumor under 35 years of age . In Western Europe with the highest incidence , the annual mortality rate of leukemia among Caucasian in North America is 3.2 ~ 7.4 / 100000 population ;
In the diagnosis and treatment of leukemia , the classification of leukemia is the key to the diagnosis , prognosis and prognosis of leukemia . With the development of biological chip technology , scholars began to apply the technique platform for diagnosis of acute leukemia . With the development of biological chip technology , the authors began to apply the technique platform for diagnosis of acute leukemia . The present experiment was aimed at providing rapid , simple and complete immunological data for clinical diagnosis and antibody targeting therapy .






Materials and Methods






1 . Material






( 1 ) Experimental specimens : peripheral blood ( 30 % of naive cells ) and peripheral blood of healthy volunteers in patients with acute leukemia in the hospital .






( 2 ) Reagents and main instruments : CD antibody , fluorescent label , antibody , immunohistochemistry kit , etc . Major instruments : biochip spotting instrument , laser confocal scanner , low temperature centrifuge , CCD image analysis system .






2 . Method






( 1 ) Determination of optimal sampling conditions






The monoclonal CD antibody with different concentrations was tested to prepare the cell chip to determine the optimal spotting condition .






( 2 ) Determination of optimal incubation conditions






( 1 ) Determination of the optimal concentration of cells : The effect of different cell concentrations on cell chip was determined to determine the best .






( 2 ) Determination of optimal incubation time : determine the effect of different incubation times on cell chip to determine the best .






( 3 ) Determination of optimal incubation temperature : The effects of different incubation temperatures on cell chips were determined to determine the best .






3 . Stability test






Accelerated experiments and long - term experiments with a period of 12 months .






4 . immunological classification of clinical specimens






72 cases of clinical leukemia were genotyped and the results were verified .






Results






1 . Best sampling conditions






When the concentration of monoclonal CD antibody was 50 渭g / mL , the signal reached saturation and the signal - to - noise ratio was the highest .
The signal - to - noise ratio of 25 渭g / mL , 12.5 渭g / mL and 6.25 渭g / mL decreased gradually .






2 . Optimal Incubation Conditions






At room temperature ( 20 鈩

本文編號(hào)：2086610