本文選題：Ag85A + DNA疫苗�。� 參考：《中國(guó)醫(yī)科大學(xué)》2007年碩士論文

【摘要】： 前言 在我實(shí)驗(yàn)室完成國(guó)家自然基金資助項(xiàng)目《腸上皮淋巴細(xì)胞在消化道潰瘍中生物活性的變化》和遼寧省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目((Ag85A基因疫苗治療膀胱癌的研究》的基礎(chǔ)上，已經(jīng)建立了與iIEL研究相關(guān)的一整套實(shí)驗(yàn)技術(shù)，如iIEL及其亞群的分離技術(shù)，細(xì)胞因子檢測(cè)技術(shù)，細(xì)胞毒及NK活性檢測(cè)技術(shù)等。本實(shí)驗(yàn)為國(guó)家自然科學(xué)基金《自制口服DNA疫苗的黏膜表達(dá)部位與誘導(dǎo)腸iIEL效應(yīng)機(jī)制的研究》中的一部分，擬采用構(gòu)建的可在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)Ag85A基因的質(zhì)粒，制成可供口服的DNA疫苗，經(jīng)口服途徑投與小鼠，以觀察DNA疫苗對(duì)IEL的生物學(xué)活性的影響為重點(diǎn)，進(jìn)行口服DNA疫苗的黏膜局部免疫應(yīng)答效應(yīng)的研究，闡明口服DNA疫苗誘導(dǎo)腸道局部黏膜免疫反應(yīng)的機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)將對(duì)口服DNA疫苗誘導(dǎo)腸道IEL的功能變化及黏膜局部免疫應(yīng)答效應(yīng)有較深入的了解，為調(diào)節(jié)腸道局部免疫功能提供新思路，并且將為口服DNA疫苗的臨床應(yīng)用進(jìn)一步提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)材料和方法 按照Pure Yield Plasmid Maxiprep System質(zhì)粒抽提試劑盒的說明從大腸桿菌中提取Ag85A質(zhì)粒，然后用BglⅡ限制性內(nèi)切酶消化質(zhì)粒，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定Ag85ADNA的存在。C57BL／6小鼠30只，雄性，6—8周齡，體重18—22克，隨機(jī)分成3組①生理鹽水組10只，經(jīng)口灌飼100μl生理鹽水；②空質(zhì)粒組10只，經(jīng)口灌飼100μl lg／L以1：1-1：0.5的比例在室溫狀態(tài)下與脂質(zhì)體乳化融合的空質(zhì)粒；③Ag85A疫苗組10只，經(jīng)口灌飼100μl lg／L Ag85A疫苗，共免疫三次，每次間隔14天，于末次免疫后的第10天頸脫位法處死各組小鼠，收集iIEL和脾細(xì)胞。用PE-cy5-CD3，F(xiàn)ITC-CD4和PE-CD8熒光抗體標(biāo)記，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析。同時(shí)用乳酸脫氫酶法測(cè)定脾NK細(xì)胞毒活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((?)±s)表示，用t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 末次免疫后10天，Ag85A疫苗組和生理鹽水組CD4~-CD8~+iIEL相比差異顯著降低(P＜0.05)，空質(zhì)粒組和生理鹽水組CD4~+CD8~-iIEL百分比相比無顯著差異；Ag85A疫苗組，空質(zhì)粒組和生理鹽水組CD4~-CD8~+iIEL百分比無顯著差異。Ag85A疫苗組和生理鹽水組脾NK細(xì)胞毒活性見有意義的變化(P＜0.05)。結(jié)果顯示口服Ag85A DNA疫苗后小鼠CD4~-CD8~+ iIEL百分比的數(shù)量顯著降低，而脾NK細(xì)胞毒活性則增加。 討論 本實(shí)驗(yàn)中小鼠在口服Ag85A DNA疫苗后出現(xiàn)了iIEL免疫功能下調(diào)和脾NK細(xì)胞毒活性提高，推測(cè)其機(jī)制可能如下，DNA疫苗的接種方法及途徑將影響其所含目的基因的表達(dá)、抗原的提呈及其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的類型。Tanglle等曾用肌肉注射和皮內(nèi)基因槍轟擊方法將Ag85A DNA疫苗投于BALB／c小鼠和C57BL小鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基因槍轟擊方法可誘導(dǎo)BALB／c小鼠的抗體水平升高和CTL應(yīng)答增強(qiáng)，但Th1型細(xì)胞因子IL-2和IFN-7分泌水平較低；而C57BL小鼠則對(duì)基因槍轟擊方法反應(yīng)較弱，對(duì)經(jīng)肌肉注射接種反應(yīng)較強(qiáng)，IL-2和IFN-γ分泌水平較BALB／c小鼠明顯升高。 另外經(jīng)口免疫耐受與粘膜相關(guān)淋巴組織關(guān)系密切，一般來說低劑量口服抗原通過主動(dòng)抑制起作用，高劑量抗原誘導(dǎo)克隆缺失和克隆無能。口服抗原作用于GALT中的調(diào)節(jié)性CD4~+T細(xì)胞，誘導(dǎo)其分泌抑制性細(xì)胞因子，如Th2或Th3類細(xì)胞因子來誘導(dǎo)免疫抑制。Tsuji等給予BALB／C小鼠口服β-乳球蛋白后發(fā)現(xiàn)，，小腸PP淋巴結(jié)中出現(xiàn)抗原特異性CD4~+CD25~+調(diào)節(jié)性細(xì)胞克隆，這些克隆具有無能的特性，且能主動(dòng)抑制β-乳球蛋白特異性抗體的產(chǎn)生。激活的CD8~+γdT細(xì)胞除本身可以分泌TGF-β、IL-10等抑制因子外，還可以促使CD4~+aβT效應(yīng)細(xì)胞向Th2／Th3表型轉(zhuǎn)化，并使得TGF-β、IL-4、IL-10等細(xì)胞因子的分泌增加，進(jìn)而發(fā)揮免疫抑制作用。CD8~+T細(xì)胞也表達(dá)抑制性表型，與腸上皮細(xì)胞共同培養(yǎng)后，CD8~+Tr細(xì)胞可進(jìn)行寡克隆擴(kuò)增，而這些細(xì)胞在炎癥性腸道疾病患者中是缺失的，這表明CD8~+T細(xì)胞也參與了免疫耐受。 結(jié)論 1、口服Ag85ADNA疫苗后小鼠CD4~-CD8~+iIEL百分比明顯降低，CD4~+CD8~-ilEL百分比未見明顯變化。 2、口服Ag85ADNA疫苗后小鼠脾NK細(xì)胞毒活性明顯提高。
[Abstract]:Foreword






In this experiment , we have established a complete set of experimental techniques related to iIEL research , such as the separation technology of iIEL and its subpopulation , the technique of cytokine detection , cytotoxicity and NK activity detection .






experimental materials and methods






Ag85A plasmid was extracted from E . coli according to the instructions of the extraction kit of the plasmid of the plasmid extracted from Escherichia coli . The presence of Ag85ADNA was identified by agarose gel electrophoresis . Thirty male C57BL / 6 mice , 6 - 8 weeks old and 18 - 22 g of body weight were randomly divided into 3 groups ( 1 normal saline group ) , and 100 渭l of physiological saline was fed through oral gavage ;
( 2 ) 10渭l lg / L of empty plasmid group and 1 : 1 - 1 : 0.5 at room temperature ;
( 3 ) Ag85A vaccine group was immunized with 100 渭l lg / L Ag85A vaccine by oral gavage for three times . Each group of mice was sacrificed at the 10th day after the last immunization . IEL and spleen cells were collected . The cytotoxicity of spleen NK cells was determined by flow cytometry . The results of the experiment were expressed by mean 鹵 SD ( 鹵 s ) , and the significance analysis was performed with t test .






experimental results






Compared with the normal saline group , the percentage of CD4 ~ + CD8 ~ - iIEL was significantly lower in the Ag85A vaccine group and the normal saline group ( P < 0.05 ) 10 days after the last immunization , and the percentage of CD4 ~ + CD8 ~ - iIEL in the empty plasmid group and the saline group was not significantly different .
There was no significant difference in the percentage of CD4 ~ - CD8 ~ + iIEL in the Ag85A vaccine group , the empty plasmid group and the physiological saline group .






discuss






In this experiment , the immune function of iIEL and the cytotoxic activity of spleen NK appeared after oral administration of Ag85A DNA vaccine . It was speculated that the mechanism might be as follows : The inoculation method and pathway of DNA vaccine could affect the expression of the target gene , the antigen presentation and the type of immune response induced . The results showed that the gene gun bombardment method could induce the increase of antibody level and CTL response in BALB / c mice , but the level of Th1 type cytokines IL - 2 and IFN - 7 secretion was lower .
Compared with BALB / c mice , the level of IL - 2 and IFN - 緯 secretion was higher in C57BL mice than in BALB / c mice .






In addition , CD8 ~ + T cells can secrete TGF - 尾 , IL - 10 and so on . The CD8 ~ + T cells can secrete TGF - 尾 , IL - 10 and so on .






Conclusion






1 . After oral administration of Ag85ADNA vaccine , the percentage of CD4 ~ - CD8 ~ + iEL was obviously decreased , and the percentage of CD4 ~ + CD8 ~ - ilEL was not changed .






2 . NK cytotoxicity of mice after oral administration of Ag85ADNA vaccine was significantly improved .
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2057536